CRISPR-Cas系統在細菌生理中的作用

陶歡，高俊，柏銀蘭

第四軍醫大學a.藥學院；b.基礎醫學院微生物學教研室；陜西 西安 710032

基因水平轉移（horizontal gene transfer，HGT）是指細菌通過轉化、接合、轉導、溶原性轉換及轉座子等獲得非自身基因的過程[1]。細菌在進化過程中，發展了一系列防御機制來抵御外源DNA 入侵，以維持自身基因結構的穩定。1987 年，Ishino 等[2]在大腸桿菌K12 的堿性磷酸酶同工酶基因（isozyme-converting alkaline phosphatase，iap）上游序列中發現14個29 bp 的重復序列及32～33 bp 的非重復間隔序列。2000年，Mojica等[3]發現該結構廣泛存在于細菌與古細菌基因組中，并具有一定的保守性。2002年，Jansen 等[4]將該重復序列命名為規律成簇的間隔短回文重復（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR），同時發現了4 個與CRISPR 重復序列功能相關的基因（CRISPR-associated，cas）。Barrangou 等[5]發現整合非自身基因的細菌具有免疫記憶，當含有相似序列的噬菌體和質粒DNA再次感染時，CRISPR-Cas系統可以限制噬菌體感染和質粒的接合，從而抑制外源性DNA 進入自身基因組，因此稱為細菌的獲得性免疫。此外，CRISPR-Cas 系統對細菌的毒力、耐藥性傳遞和生物膜形成等生理特性均有影響。

1 CRISPR-Cas系統概述

1.1 CRISPR-Cas系統組成

CRISPR-Cas 系統由重復序列（repeat）、前導序列（leader）和cas基因構成。

CRISPR 結構以連續相同的重復序列為主要特征，一般長24～47 bp。在重復序列間含有高度特異性的插入短序列，又稱間隔序列（spacer）。細菌獲得的新間隔序列若與入侵噬菌體某段序列相同，則細菌可以對該噬菌體起獲得性免疫作用[5]。

CRISPR 的5'端與第一個重復序列相連的一段富含AT 的序列被稱為前導序列。前導序列在細菌種內相對保守，但存在種間差異[6]。前導序列為新的插入序列提供了識別位點，該識別位點為研究細菌的進化提供了重要依據。

cas基因常出現在CRISPR 側翼區域，目前已發現多種cas基因，該基因在不同的細菌中差別較大。cas基因編碼CAS 蛋白，CAS 蛋白與核酸的重組和修復、新間隔序列的獲得、重復序列的維持等有關[6-7]。根據其保守程度，可將cas基因分為核心cas基因、亞型特異性cas基因和RAMP（repeat-associated mysterious proteins）組件基因。其中RAMP可編碼CAS蛋白超家族，該家族蛋白含有RNA 識別結構域（RNA recognition motif，RRM），并含有富含甘氨酸的莖環結構[7]，具有RNA 酶活性，與crRNA（CRISPR RNA）前體的轉錄及加工過程有關[8-10]。

1.2 CRISPR-Cas系統分類

2011 年，Makarova 等[11]將CRISPR-Cas 系統分為3 類，即TypeⅠ、Ⅱ、Ⅲ。典型的TypeⅠ系統均含有cas3基因，該基因在解旋酶及DNA 酶等作用下可編碼大量蛋白。TypeⅡ系統的基因相對保守，且僅存在于細菌中，而不存在于古細菌中，根據cas1、cas2和cas9基因的變異分為3 個亞型，即具有cas2附加基因的TypeⅡ-A 系統、具有cas4附加基因的TypeⅡ-B 系統和無附加基因的TypeⅡ-C 系統[11]，TypeⅡ系統的cas9基因可編碼大量蛋白質，參與crRNA 的轉錄加工并裂解靶DNA。TypeⅢ系統編碼聚合酶和RAMP 分子，分為2 個亞型，即可識別靶DNA 序列的TypeⅢ-A系統和識別RNA的TypeⅢ-B系統。

1.3 CRISPR-Cas作用機制

CRISPR-Cas 系統使細菌對外源性DNA 的侵襲免疫，而不降解自身的基因。Jiang 等[12]發現當細菌中轉入有益的傳遞基因時，CRISPR 基因功能會缺失，使細菌通過HGT 獲得某些新性狀；而當轉入基因對細菌的生存構成威脅時，CRISPR 的表達會發生上調。Marraffini 等[13]將CRIPSR 在細菌中的適應性免疫作用稱為CRISPR 干擾，并將CRISPR 干擾分為3 個階段：首先，細菌從病毒、噬菌體的侵入基因或外源質粒中特異性整合短序列，并將其插入基因組形成新的間隔序列，使細菌可以快速適應環境中的入侵者，稱為CRISPR發揮功能的“適應階段”；其次，新的間隔序列在CRISPR位點插入后，重復序列和插入序列可編碼出一條crRNA，使細菌進入特異性的防御階段；最后，crRNA經剪切加工后形成的小RNA與CAS 蛋白組成效應復合物，通過堿基互補配對與再次入侵的目標DNA 相結合，隨后CAS 蛋白對外源性靶DNA進行斷裂和裂解。

2 CRISPR-Cas在細菌生理中的作用

2.1 CRISPR對細菌毒力的調節

CRISPR 可以使細菌對外源基因產生獲得性免疫，該過程中獲得的新間隔序列可能導致細菌毒力的改變。噬菌體感染是細菌獲得毒力和致病性的重要方式，如大腸桿菌、棒狀桿菌、肉毒梭菌、霍亂弧菌、鏈球菌和金黃色葡萄球菌均含有編碼毒力因子的溫和噬菌體基因[14]。而這些細菌的CRISPR 間隔序列與原噬菌體序列存在相互排斥，說明細菌中的CRISPR-Cas 系統可以通過抵御毒性噬菌體來干擾毒力因子在致病菌間的傳播。

腸出血性大腸桿菌（EHEC）的志賀毒素和黏附素分別由噬菌體基因stx和eae編碼，在stx和eae基因基礎上對CRISPR 多態性進行分析，表明CRISPR的基因型與EHEC 種群的毒力相關，并且與O∶H 血清型分析相結合，可使EHEC的分型更確切[15]。在其他大腸桿菌菌株中，CRISPR 序列相對較短，在進化中相對穩定，主要起免疫保護和阻止抗藥性質粒傳遞的作用，這一特點也有利于鑒定致病性大腸桿菌。

Nozawa 等[16]發現化膿性鏈球菌中的CRISPRCas系統使噬菌體毒力基因轉入，使這些菌株產生了致病性。對13 株化膿性鏈球菌基因組測序[17]，發現其中2 株CRISPR 位點的間隔序列與其他被測菌株存在差異，而5 株菌CRISPR-Cas 系統中的cas基因缺失。這些菌株均含有大量前噬菌體基因，且CRISPR結構均為TypeⅡ-A CRISPR-Cas系統，噬菌體基因的高感染效率與其特殊的CRISPR-Cas系統相關。

CRISPR-Cas 系統可干擾細菌獲取毒力基因。Bikard等[18]對肺炎鏈球菌莢膜編碼基因的研究表明，CRISPR 干擾作用可使無莢膜的肺炎鏈球菌獲得編碼莢膜的毒力因子，而少數缺失CRISPR的肺炎鏈球菌則可被毒力菌株感染，接受莢膜基因，這表明CRISPR 干擾作用可以阻礙菌體獲得毒力。Van Schaik 等[19]對腸球菌CRISPR 結構的研究表明，其cas1基因的缺失會導致致病島的增多。空腸彎曲菌強毒株可造成嚴重的胃腸炎和感染后嚴重并發癥，分析發現其CRISPR 序列較短或完全缺失[20]，說明CRISPR的缺失導致細菌毒力增強。

大多數致病菌如化膿性鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、空腸彎曲菌等均含有TypeⅡCRISPR-Cas 系統[21-22]。通過對多種致病菌CRISPR 序列及毒力編碼基因的研究表明，TypeⅡCRISPR-Cas 系統中的cas9基因在細菌毒力調節過程中起至關重要的作用[11,23-24]。Louwen 等[1]研究表明，CRISPR-Cas 系統可以通過反義RNA 作用沉默具有免疫原性膜蛋白的表達，從而使細菌的毒力下降，且不同細菌介導該毒力調節作用所需的RNA 分子不同。cas9基因廣泛存在于各種宿主病原菌內，提示TypeⅡCRISPR-Cas 系統在細菌的毒力調節中起到重要作用[24]。

2.2 CRISPR在細菌耐藥性傳遞中的作用

HGT 是決定細菌耐藥性傳遞的重要機制，如耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（MRSA）和耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌（VRSA）的抗藥性基因均可通過質粒的接合傳遞[5]。對強毒的MRSA USA300 菌株進行序列分析表明，細菌CRISPR位點中的間隔序列是通過HGT獲得的，噬菌體或質粒DNA 的基因序列整合到CRISPR位點，使細菌獲得新間隔序列而產生耐藥性[25]。此外，Kelli 等[26]研究發現多耐藥腸球菌均缺乏CRISPR-Cas 系統元件，表明細菌中的CRISPR-Cas系統在阻礙耐藥性傳遞中具有重要作用。

致病性的金黃色葡萄球菌和條件致病性的表皮葡萄球菌是最常見的院內交叉感染菌株，其基因成分可以通過接合作用在不同種群間傳遞[27]。非致病的表皮葡萄球菌12228 株缺乏CRISPR 序列，而臨床分離的RP62a 株則含有CRISPR 序列。RP62a 的間隔序列（spc1）與所有已知葡萄球菌屬接合質粒編碼核酸內切酶的基因具有同源性序列[28-29]，為檢測spc1是否能阻止質粒向RP62a 表皮葡萄球菌傳遞，Marraffini 等[27]將金黃色葡萄球菌耐β-內酰胺質粒pG0400 的9 個核苷酸內切酶位點基因沉默，產生突變型pG0，然后將野生型及突變型pG0400（即pG0）轉入2 種表皮葡萄球菌，結果表明轉入無CRISPR 結構的12228菌株中的2種質粒的接合效率相近，但轉入含有CRISPR 序列的RP62a 菌株時只有突變型pG0轉入成功，且與對照組中12228菌株轉入野生型pG0400 的轉化效率相近。該結果表明，CRISPR 干擾可以限制耐藥性pG0400 質粒通過接合作用從金黃色葡萄球菌轉移到表皮葡萄球菌，其特異性取決于間隔序列與質粒序列的一致性，且該阻礙機制由靶DNA 直接介導，說明細菌中CRISPR 序列可通過阻礙HGT阻斷細菌耐藥性的傳遞。

2.3 CRISPR-Cas對細菌生物膜的影響

生物膜形成和群聚運動是影響細菌致病性的重要因素。Zegans 等[30]發現噬菌體DMS3 感染銅綠假單胞菌產生的溶原性細菌無法形成完整的生物膜，并影響其群聚運動能力，還發現其生物膜形成的抑制和群聚運動能力喪失需要宿主體內CRISPR 的存在，且cas基因的亞類，如PA14_33350（cas1）可編碼整合酶[30]，該整合酶可能參與新噬菌體DNA 序列整合入細菌CRISPR的過程，影響了細菌生物膜的形成及群居運動等生理活性。CRISPR 介導的生物膜形成及群聚能力的改變，或許是限制細菌噬菌體在細菌間傳播的重要機制，即被噬菌體感染的細菌將自己從生物膜及其他群體行為中隔離，以減少大范圍感染細菌群體的幾率。Palmer 的研究表明[31]，TypeⅠ-F CRISPR特異性插入序列是抑制銅綠假單胞菌生物膜形成所必需的，推斷可能是該特異性插入序列轉錄形成反義RNA，沉默銅綠假單胞菌的生物膜形成基因，導致生物膜的形成受到抑制。因此，CRISPR-Cas系統可調節細菌生物膜形成。

2.4 CRISPR對細菌感染宿主的影響

研究表明，細菌中CRISPR-Cas系統與其感染宿主范圍具有內在聯系。雞敗血支原體是一種可以感染多種禽類的細菌，其CRIPSR 結構具有高度多樣性，菌株中均具有TypeⅡCRISPR-Cas 結構，且其CRISPR 結構不斷更新[32]。當該細菌的宿主從家禽向飛禽轉換時，CRISPR 間隔序列的多樣性大量減少，并伴有TypeⅡcas基因缺失，且其CRISPR 序列的更新停滯，表明該細菌的CRISPR結構可隨宿主的轉變發生突變，使細菌快速進化以適應新的宿主[32]。另外，Felizza 等[33]發現嗜肺軍團菌具有TypeⅡCas2核酸酶，可以增強其對阿米巴宿主細胞的胞內感染，而嗜肺軍團菌對阿米巴的侵入對其在環境中的生存至關重要。弗朗西斯菌是一種胞內寄生菌，可逃避宿主的免疫系統，在宿主細胞內復制。該細菌被巨噬細胞吞噬后，吞噬體中的多種抗菌物質及固有免疫反應對其均具有殺傷作用，而該菌株CRISPR-Cas系統中的cas9、tracrRNA 等可作為調節因子，使其逃避宿主的抗菌作用，在宿主細胞中存活。對人上皮細胞模型的研究發現cas9是腦膜炎奈瑟菌吸附于宿主細胞表面并侵入宿主細胞進行復制的關鍵[34]。另外，cas9基因的存在對空腸彎曲菌吸附入侵結腸上皮細胞也同樣重要[20]。說明TypeⅡCRISPR-Cas 系統在細菌感染宿主過程中發揮重要作用。

3 結語

CRISPR-Cas 系統的發現，更新了人們對細菌生理功能調節的認識。利用CRISPR-Cas 系統控制基因在細菌間的水平轉移，應用于細菌基因組編程，可獲得預期細菌的新表型，如生長增加、毒力更低、藥物敏感或耐受等，為科學研究提供了重要工具。通過分析CRISPR結構中間隔序列的變異，建立了一種新的基因分型方法“間區序列寡核苷酸分型法”或“sp寡核苷酸分型法”，有利于細菌分型、流行病學研究及臨床細菌性疾病診斷[35]。CRISPR 可干擾耐藥性質粒的接合作用，通過對其結構的修飾將使限制耐藥菌株的傳播成為可能，為耐藥菌的控制提供了新的思路。此外，CRISPR-Cas9作為一種高效、簡便的基因組編程技術，已廣泛應用于相關研究領域。隨著研究的深入，細菌CRISPR-Cas系統還將應用于人類基因修復及疾病治療。

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