線蟲乙酰膽堿酯酶基因研究進展

陳玉艷，胡長志，崔汝強（江西農業大學 農學院，江西 南昌 330045）

線蟲乙酰膽堿酯酶基因研究進展

陳玉艷，胡長志，崔汝強*
（江西農業大學 農學院，江西 南昌 330045）

乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase， AChE， EC 3.1.1.7）是生物神經傳導中的一種關鍵性酶。它可以降解膽堿能突觸間的乙酰膽堿，終止神經遞質對突觸后膜的興奮作用，從而保證神經信號在生物體內的正常傳遞。分析線蟲乙酰膽堿酯酶基因的特征，介紹已報道的線蟲AChE 基因的特點和功能，對線蟲AChE基因研究中存在的問題和前景進行分析和展望。

線蟲；乙酰膽堿酯酶；乙酰膽堿酯酶基因

陳玉艷， 胡長志， 崔汝強. 線蟲乙酰膽堿酯酶基因研究進展［J］. 生物災害科學， 2015， 38（4）:284-289.

線蟲屬于線形動物門的線蟲綱，廣 泛分布于自然界中。人 們最早發現的線蟲是人和動物的寄生線蟲，隨后才發現了植物寄生線蟲。如今植物寄生線蟲已是世界農作物的重要病原物之一，至 2003 年，有人統計平均每年全世界農作物因植物寄生線蟲危害造成的損失高達 1 250 億美元［1］。隨著人們對植物寄生線蟲研究的深入，與線蟲運動相關的基因漸漸成為關注的焦點。

線蟲的運動是由線蟲體壁縱肌收縮及角質層的彈性改變共同完成的；假體腔充滿體腔液，在膨壓的作用下形成一個支撐和傳送肌肉收縮的流體靜力學支架，使線蟲不能伸縮運動，只能表現出身體背腹方向的蛇行運動。同時，在線蟲的背、腹神經索存在著神經-肌肉突觸，由興奮性神經遞質乙酰膽堿（ACh）來調節它們的肌肉活動［2］。乙酰膽堿主要存在于突觸前的膽堿能神經末梢部位，是膽堿和乙酰輔酶 A在膽堿乙酰移位酶（膽堿乙酰化酶）的催化作用下合成的。線蟲的膽堿能系統一直是許多控制動物和植物寄生線蟲的化合物靶標，而作用于這個系統的化合物大多針對的是乙酰膽堿酯酶［3］。乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）是大多數生物神經傳導中的一種關鍵性酶。該酶的“經典”功能是在膽堿能突觸通過水解乙酰膽堿來終止該類神經遞質對突觸后膜的興奮作用，保證神經信號在生物體內正常傳遞［4］。 正是 AChE 這種“經典”功能，使 AChE 成為目前世界上施用最廣的氨基甲酸酯類和有機磷類殺蟲劑的作用靶標［5］。此外，AChE 基因也能在非神經組織中表達，具有一些與神經沖動傳遞無關的“非經典”功能［6］。例如，AChE 在誘導軸突生長、突觸形成、凋亡、促進造血細胞形成和免疫反應等起作用［7］。深入了解 AChE 基因功能對開發新的植物寄生線蟲防治策略有著重要意義。

1　線蟲AChE的研究

乙酰膽堿酯酶（AChE）最初是在蛔蟲（Ascaris）中描述的，后來才在線蟲中發現［3］。 在對蛔蟲的研究中表明，蛔蟲運動的3種神經元，具有顯著的乙酰膽堿轉移酶活性，這也暗示了乙酰膽堿酯酶的功能［8］。 乙酰膽堿酯酶以可溶形式出現在膽堿能神經末端，起到調節游離乙酰膽堿濃度的作用。對線蟲組織化學染色和適當透化后，發現乙酰膽堿酯酶在靠近神經環和縱神經索附近有著廣泛的肌肉神經位點［9］，這表明乙酰膽堿酯酶與線蟲的肌肉運動有關。如果線蟲肌肉處于過度收縮，一些氨基甲酸酯類和有機磷類的乙酰膽堿酯酶抑制劑會使秀麗小桿線蟲（Caenorhabditis elegans）癱瘓。研究發現 AChE 普遍存在于寄主中，在不同的寄主中其功能也不同，動物寄生線蟲分泌的 AChE，負責減少寄主腸道的運動性能，而植物寄生線蟲分泌的乙酰膽堿酯酶是調節寄主的抗性和免疫反應。乙酰膽堿酯酶也存在于一些線蟲的食道腺及排泄系統中，如錫蘭鉤口線蟲（Ancylostoma ceylanicum）、馬來絲蟲（Brugia malayi）、胎生網尾線蟲（Dictyocaulus viviparous）、巴 特斯細頸線蟲（Nematodirus battus）、巴 西日圓線蟲（Nippostrongylus brasiliensis）和毛圓線蟲（Trichostrongylus colubriformis）等等［9］。

上海交通大學 Wu等［10］2 008 年通過誘導畢赤酵母（Pichia pastoris）表達獲得了一種新型重組黑腹果蠅（ Drosophila melanogaster）的 乙酰膽堿酯酶（ R-DmAChE），證 明它比從電鰻（ Electrophorus electricus）、巴西日圓線蟲（N. brasiliensis）和人類得到的 AChE 更具敏感性。Li Bing等［11］從家蠶（Bombyx mori）中克隆了Bm-AChE-1和Bm-AChE-2兩種基因，毒 扁豆堿和對氧磷對其抑制作用的研究結果表明，A ChE-2 比 AChE-1 更敏感。將接觸辛硫磷的家蠶的兩種 AChE 基因進行克隆表達，發現Bm-AChE-1 在大腦、脂肪、中 腸和絲腺組織中的表達均高于 Bm-AChE-2，這 一結果揭示了在家蠶正常的生理作用和代謝過程中，Bm-AChE-1可能具有更重要的地位。在研究中還發現，辛硫磷一旦被家蠶的中腸吸收，會抑制 AChE 的活性，從而抑制了 Bm-AChE-1 和Bm-AChE-2 的表達，這將影響突觸神經元傳導，導致家蠶生理障礙［12］。將南方根結線蟲（Meloidogyne incognita）和爪哇根結線蟲（M. javanic）的乙酰膽堿酯酶同電鰻的乙酰膽堿酯酶進行靈敏性比較，發現南方根結線蟲和爪哇根結線蟲對各種抑制劑均表現出相似的靈敏度，而來自電鰻的乙酰膽堿酯酶則對苯線磷和涕滅威更為敏感，對滅克磷和毒扁豆堿不太敏感［12］。 上述所有的證據表明，至少有一些 AChE 在生物的發育及運動過程中起著重要作用。

2　線蟲AChE分子型

人們在動物中發現，一些乙酰膽堿酯酶或真性膽堿酯酶有著不同的分子形式［13］。它們以非對稱（A）的形式和球狀（G）的形式出現，其中，A形式以 A4，A8 和 A12 的形式出現；G 形式以 G1，G2 和 G4的形式出現，對應酶催化亞基的單體，二聚體和四聚體。事實上，在很長時間內人們認為線蟲只有單一的分子型。但是后來通過對自由生活線蟲秀麗小桿線蟲和植物寄生物種南方根結線蟲和大豆胞囊線蟲（Heterodera glycines）等線蟲的研究表明，線蟲 AChE 不具有其他動物種類中常見的、與許多 AChE 有關的膠原尾，而是球狀單體（G1）、二聚體（G2）和四聚體（G4）。并且球狀單體（G1）和二聚體（G2）這兩種蛋白質的分子量，大約分別為 80和 189 kDa［13］。依據其溶解性又可分為兩親分子和非兩親分子，這些分子型又組成了不同類型的 AChE，并由多種基因編碼，其編碼的不同類型在底物的親和力，大小，洗滌劑靈敏度以及對抑制劑的感應等方面均有很大的差別［3］。在 桑蠶 AChE 基因的分子特征研究中發現，Es-AChE 和 Bm-AChE2 的同一性為 58%，Es-AChE 和 Bm-AChE1 的同一性僅為 36%，說明寄生蟲和寄主的 AChE 氨基酸序列有很大不同［14］。

許多動物寄生線蟲能通過側腺活躍地分泌 AChE。這些分泌的 AChE 與神經—肌肉突觸間的 AChE有著明顯的差異。秀 麗小桿線蟲、南 方根結線蟲及大豆胞囊線蟲等線蟲均含有三個活躍的乙酰膽堿酯酶，可被分成兩類，是對應于其他線蟲物種的 A和 C 類［3，15］。 C 類 AChE 可能發生在秀麗小桿線蟲的一對與排泄管有關的神經元——CAN 細胞，相比之下，A類和 B 類主要發生在背側和腹側的神經肌肉接點［15］。這些酶類在線蟲體內的多少和分布可能是影響抑制劑對線蟲行為作用的重要因素。乙酰膽堿酯酶的分布與定位在線蟲的恢復過程中也起著重要的作用，同時線蟲分泌的乙酰膽堿酯酶的分子形式不同也可能會造成不同的效應［3］。

3　線蟲AChE基因型

1986 年，人們從果蠅（Drosophila）和黑腹果蠅（D. melanogaster）中克隆到第一個昆蟲乙酰膽堿酯酶基因，當時將它劃分為ace-2一組［16］。 隨后，又在庫蚊（Culex pipiens）中發現了編碼AChE的兩種基因，之后才在其它蚊類中發現［17］。 瘧蚊（Anopheles gambiae）和棉蚜（Aphis gossypii）、桃蚜（Myzus persicae）［18］都有兩個 AChE 基因，其中，瘧蚊（A. gambiae）的 ace-1 對有機磷類殺蟲劑有抵抗力，因此選擇受到抑制；a ce-2 是性連鎖基因，只 是它的具體功能仍未知［16］。并 且，通 過酶學測定法檢測不到 ace-2 中的 AChE活力，表明 AChE 酶活性要么很低，要么范圍很小，因而估計 ace-2 在突觸 AChE 中起很小的作用［19］。有研究發現，蒼蠅中的 ace-2 基因只編碼其主突觸功能基因，但在其它昆蟲中并非如此［17］。最近 ace 基因在瘧蚊、伊蚊（Aedes aegypti）、庫蚊、黑腹果蠅中的克隆與序列分析，提供了一個在基因水平上與其它蚊類物種比較的新機會［19］。

線蟲與昆蟲不同，多數昆蟲 AChE 是單基因編碼，而線蟲 AChE 由多基因編碼。近年來對多種線蟲尤其是以秀麗小桿線蟲為模式物種，對 AChE 的相關基因進行克隆和研究，揭示了結構和組織分布，并推測其分別演繹的功能。對秀麗小桿線蟲中乙酰膽堿酯酶的缺失突變體進行遺傳分析，發現乙酰膽堿酯酶類線蟲有四個無關聯結構基因（ace-1， ace-2， ace-3 和 ace-4）［20］。除 ace-4外，其它三個基因分別編碼A類型、B 類型和C類型的AChE，在 染色體X上的ace-1編碼AChE-1，染 色體I上的ace-2編碼AChE-2，染色體Ⅱ上的 ace-3 編碼 AChE-3［3］。 編碼秀麗小桿線蟲 AChE-1 的 ace-1 主要分布在線蟲的體壁肌細胞。AChE-1 是一個兩親分子四聚體，具有一疏水的非催化亞基，與脊椎動物的 AChE 催化亞基 AChE（T）相類似，并在花生根結線蟲（M. arenaria）和南方根結線蟲中發現該亞基［21］。對于秀麗小桿線蟲這個各個階段均是移動的自由生活線蟲，ace-1的表達在幼蟲階段達到一個最大值［22］。秀麗小桿線蟲的 ace-2是一種結合有糖基磷酯酰肌醇結構的兩親分子二聚體。其 C 末端是疏水的，與脊椎動物 AChE（H）結構非常相似，都有一個 GPI 錨定位點。秀麗小桿線蟲、南方根結線蟲和胎生網尾線蟲的 AChE-2 在 C 末端均有一個自由的半胱氨酸殘基，位 于錨定位點的上游并參與鏈間二硫鍵的形成［23］。秀 麗小桿線蟲的 ace-3 和 ace-4兩基因均位于染色體Ⅱ，其間有 356 個核苷由 ace-4的終止密碼子和 ace-3 的啟始密碼子分離開來。AChE-3 與 GPI 結構相結合成兩親分子二聚體［24］。盡管從秀麗小桿線蟲中分離了 AChE 的類型 D，但 ace-4的功能仍然不確定，這也為后人研究其他相關基因奠定了基礎。

任何單一類乙酰膽堿酯酶的缺失突變對線蟲沒有明顯的表型行為效應；其中，缺乏 AChE-1 和AChE-2 突變株出現行為不協調，但發育正常；缺乏 AChE-3 和另外兩個基因其中之一，除了后退有點困難，其他行為幾乎是正常的；所有這三類的缺失則是致命的。三個可能的雙表型突變體揭示了 ACE-1 或ACE-2 是必要的正常運動基因，至少需要這三個功能基因中的一個。三重突變體的生存能力可以通過在該基因編碼的突變處摻入還原膽堿乙酰轉移酶、乙酰膽堿合成酶來鑒定。這些線蟲缺少功能性膽堿能系統，雖然行為嚴重不協調，但它們能夠生長和繁殖。在植物寄生線蟲中，目前已經克隆的乙酰膽堿酯酶基因包括南方根結線蟲的 Mi-ace-1 和 Mi-ace-2，爪哇根結線蟲的 Mj-ace-2，甘薯莖線蟲的 Dd-ace-1、Dd-ace-2 和Dd-ace-3，馬鈴薯白線蟲（Globodera pallida）的 Gp-ace-2和大豆胞囊線蟲的 Hg-ace-2，并對基因的結構功能、表達特性和進化機制等進行了深入研究［25］。 原位雜交的結果表明植物寄生線蟲 ace基因在線蟲食道腺細胞中表達，但不同的植物寄生線蟲中 ace 基因表達的時間和表達的量有明顯差異，這說明ace在線蟲寄生過程中可能有不同的作用［26］。南 方根結線蟲中Mi-ace-2在線蟲的各個蟲態均表達，在二齡幼蟲和雌蟲的表達量高于雄蟲和卵；大 豆胞囊線蟲中 Hg-ace-2 主要在卵和寄生早期的二齡幼蟲中表達［27］。 對乙酰膽堿酯酶基因的研究，英國洛桑實驗站的 Dong等人［18］2 005 年已經從棉蚜和桃蚜體內克隆了 ace-1 和 ace-2，并且將其命名為果蠅直系同源 ace-2 和突觸基因 ace-1。在雙翅目蠅類，例如果蠅、黑腹果蠅、銅綠蠅（Lucilia cuprina）、橄欖果實蠅（Bactrocera oleae）和家蠅（Musca domestica）等等中僅僅只有 ace-2 類型的基因［14］。 通過在體外表達蚜蟲的 ace-1 和 ace-2 試驗表明，ace-1 主要是編碼棉蚜的突觸乙酰膽堿酯酶［18］。 關于國內的研究，丁中等［23，28-29］從甘薯莖線蟲中克隆了 3 個乙酰膽堿酯酶基因（Dd-ace-1， Dd-ace-2 和 Dd-ace-3）。熊玉芬等［25］通過分離江蘇省連云港市松樹萎焉病病死松樹的氨基酸序列比對和同源性分析顯示，松材線蟲 Bx-ace-2 編碼的乙酰膽堿酯酶與已報道的秀麗小桿線蟲AChE-1、AChE-3 和 AChE-4 型乙酰膽堿酯酶的相似性為 28%～31%，而與秀麗小桿線蟲 AChE-2 及甘薯莖線蟲、南方根結線蟲、大豆胞囊線蟲、馬鈴薯白線蟲和胎生網尾線蟲的 AChE-2 型乙酰膽堿酯酶的氨酸序列相似性為 44%～52%。構建的系統進化樹也顯示，松材線蟲乙酰膽堿酯酶與其他線蟲 ACE-2 型乙酰膽堿酯酶具有相對更近的遺傳距離，因此推測該松材線蟲乙酰膽堿酯酶也屬于 ACE-2型。由于線蟲存在多種基因編碼 AChE，克隆 AChE 基因顯得尤為重要。

4　線蟲AChE藥理學特性

乙酰膽堿酯酶是維持神經系統正常功能的關鍵性酶，多年來一直是農藥毒理學研究的重點之一。乙酰膽堿酯酶原來是治療寄生蟲病的重要靶標，如今抗膽堿酯酶類農藥被廣泛用于害蟲防治。由于這些化合物（一般是有機磷和氨基甲酸酯類）相關的毒性，導致它們在許多國家限制使用［30］。 同時，該類殺蟲劑的廣泛使用導致大量農林害蟲產生了明顯的抗藥性［4］。 例如，秀麗小桿線蟲經氨基甲酸酯類和有機磷類殺線劑處理 24 h后，線蟲的 AChE 活性恢復迅速，其中涕滅威處理過的線蟲經 24 h恢復期后，線蟲的AChE 活性幾乎完全恢復，但經苯線磷處理的線蟲經24 h恢復期后，與未經藥劑處理的線蟲相比，僅恢復約 10%的 AChE 活性，但這樣小量的 AChE 活性己足以使線蟲恢復正常活動［3］。鑒定表明，胞囊線蟲對氨基甲酸酯類和有機磷類殺線劑的敏感性要比根結線蟲低［15］。當前防治甘薯莖線蟲（Ditylenchus destructor）的主要藥劑為 AChE 抑制劑，如涕滅威、滅線磷等，由于這些殺線劑毒性高對環境污染大，不可持續使用。因此，開展對植物寄生線蟲 AChE 的研究，既有助于深入了解線蟲 AChE 的特性，又可以進一步開發新的防治途徑和方法。值得注意的是，在這些化合物中差別很大的結構和非共價鍵，通過不同酶的位點，提供許多不同的起始作用，暗示了在未來的藥物設計研究中這是一個富有成效的領域。

目前，檢測到編碼膽堿能突觸的 AChE 基因，可以識別耐藥菌株的突變點，減少靶標的敏感性，從而賦予殺蟲劑耐藥性［19］， 這有利于今后的研究。乙酰膽堿酯酶為防治寄生線蟲提供了重要的神經肌肉靶標，通過它人們有可能開發出更多的選擇性抑制劑。例如，乙酰膽堿酯酶復合使用抑制劑用于阿爾茨海默氏病（Alzheimer disease，AD）的治療最近已取得了較好的進展。研究發現，雙位點作用的 AChE 含有兩個重要的結構域：一個是位于活性口袋底部的催化位點（catalytic anionic site，CAS），由 Ser200、His440 和 Glu327 組成；另 一個是位于入口處，以 Trp279 為中心的外周陰離子位點（ peripheral anionic site，PAS）。經典的乙酰膽堿酯酶抑制劑（AChEIs）多作用于 AChE 催化位點，通過抑制乙酰膽堿水解來提高 AD 患者腦內的 ACh 水平，達到改善其學習記憶能力和認知水平的治療目的［31］。因此，篩選具有較好活性的天然乙酰膽堿酯酶抑制劑（AChEI），發現高活性的先導化合物，并且通過進一步的結構改造與修飾，從而開發出治療 AD 的藥物，對人類社會的發展具有重要意義［32］。這類藥物對人類健康的影響遠遠大于對動物健康的影響，并有可能針對乙酰膽堿酯酶這類新靶標開展深入研究。

5　展　望

線蟲基因組的研究促進了線蟲 AChE 基因的研究，包括線蟲 AChE 基因的克隆、表達與純化、結構與功能的分析，但對植物寄生線蟲 ace 調控和分子進化研究還處于起始階段。盡管知道了植物寄生線蟲AChE 為多基因編碼，但其實質以及它們的生物學意義仍不清楚。這些研究推動了昆蟲靶標抗性分子遺傳的研究。鑒于對植物寄生線蟲 ace 的調控機理研究較少，雖然有些抗性害蟲的 AChE 已被證實對殺蟲劑敏感度下降，卻仍未發現有ace 突變的現象，目前無法進行解釋［33］。

乙酰膽堿酯酶（AChE）是一種催化乙酰膽堿分解的水解酶，它與有機磷農藥有特異反應［34］。針對AChE 利用基因工程技術進行有機磷農藥的快速檢測、人類疾病防治、生態環境保護和害蟲的抗藥性等方面的研究具有非常重要的意義［35-36］。 隨著 x-衍射技術、原子力學顯微技術、基因工程定點突變技術、計算機模擬技術等的發展，相信在不久的將來，在 AChE 的結構和功能的研究、AChE 的遺傳學研究以及不同生物 AChE 的分子生物學機制研究等方面必將取得新的成果。但是，由于當前 AChE 的研究重點主要集中在生化毒理學、神經生物學和藥理學方面，確切地說，主要集中在昆蟲抗藥性、人類疾病防治等研究領域，而在環境保護以及植物寄生線蟲病害的防治方面卻很少涉及。因此，如果要想 AChE 在農業病蟲害防治方面發揮更大的作用，就必須深入開展AChE 基因的相關研究，運用這些技術獲得有效的現實意義。

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Research Advances of Acetylcholinesterase Genes from Nematodes

CHEN Yu-yan， HU Chang-zhi， CUI Ru-qiang*
（College ofAgronomy， Jiangxi Agricultural University， Nanchang 330045， China）

Acetylcholinesterase（AChE， EC3.1.1.7）is a key enzyme in biological nerve conduction. Between cholinergic synapses， the enzymatic degradation of acetylcholine could terminate the effects of neurotransmitters epicuticular on postsynaptic membrane excitation， so as to ensure the neural transmission of nerve signals in vivo. The gene characteristics were discussed， and all the structure characteristics and the function of the ace genes from nematodes reported were also discussed in this passage. Finally， the problems and prospects in the studies of nematode ace were also analyzed.

nematodes； acetylcholinesterase； acetylcholinesterase genes

S763.3

A

2095-3704（2015）04-0284-06

2015-10-10

國家自然科學基金項目（31260423）和江西省研究生創新項目（YC2014-S198）

陳玉艷，女，研究生，主要從事植物病原線蟲學研究，E-mail:646816329@qq.com；*通信作者：崔汝強，副教授，博士，E-mail:cuiruqiang@jxau.edu.cn。