樹鼩遺傳多樣性的研究進展

楊香娣，曹驥，楊春

（廣西醫科大學附屬腫瘤醫院，南寧 530021）

早期學者認為樹鼩在分類學上被視為攀鼩目，它是形似松鼠的一種小型哺乳動物。目前，攀鼩目一共包括筆尾樹鼩科和樹鼩科2科5屬。樹鼩科下有菲律賓樹鼩屬、細尾樹鼩屬、南印樹鼩屬和樹鼩屬4個屬，但筆尾樹鼩科只包含了筆尾樹鼩屬1個屬，也有人提出了該把菲律賓樹鼩屬歸類于樹鼩屬［1］。目前地理區域分布最廣的攀鼩目動物是中緬樹鼩。但由于國內地理優勢和樹鼩的分布特征，對樹鼩的研究在國內偏多且處于領先地位，但現用于實驗的樹鼩多數來自野外或品系不純，對樹鼩群體的遺傳背景尚不太清楚，這使樹鼩在科學研究中的管理和應用受到了極大的限制。因此，通過開展對樹鼩群體遺傳多樣性的研究，建立一個遺傳背景清晰明了的樹鼩品系十分重要。隨著研究和保護生物多樣性成為目前世界各地的關注熱點，物種遺傳多樣性的研究受到了越來越多的重視。通常說到的遺傳多樣性是指種群之間和種群內不同個體間的遺傳變異總和。研究某一物種的遺傳多樣性不但可以了解到其群體遺傳結構與多態性差異，同時也為物種分類、充分利用與保護已有的種質資源提供重要的依據。遺傳多樣性的研究主要包括表型、染色體、蛋白質及DNA水平等方面的內容。現將目前國內外對樹鼩遺傳多樣性在各水平的研究動態綜述如下，以期為樹鼩的合理利用和遺傳育種提供更多的依據。

1 表型多樣性

基于表觀形態特征的研究是遺傳多樣性研究最直接和原始的方法，然而由于樹鼩的表型多樣化，目前國內外學者對樹鼩的分類方法并不一致。王應祥［2］通過標本采集等方法研究了中緬樹鼩不同亞種之間的表型水平差異，發現在體型大小、體質量大小、尾長等方面存在不同特征，進一步說明樹鼩種內遺傳變異是多樣的，不同性狀在不同水平上的變異程度也不同。Wu等［3］通過測量昆明近郊樹鼩的體質量發現，同一種群內4～12月齡樹鼩雄性個體體質量顯著高于雌性個體，且隨著月齡的增加，這種性別之間的差異會逐漸減小。李波等［4］通過對樹鼩解剖發現，7～9個月齡雌、雄樹鼩在心、肺、左海馬、右腎、左右甲狀腺、左頜下腺、左腎上、小腸、腺膀胱、右海馬重量及系數都有較明顯差異;而右頜下腺、脾及左腎僅重量有明顯差異，無系數大小差異;胃、腦、大腸、右腎上腺系數有差異，但重量上無差異。于永梅等［5］通過對人工繁殖條件下的35只中緬樹鼩主要外貌特征研究，發現中緬樹鼩典型的外貌特征是野生型，毛色有季節性紅斑、沒有白眼圈、白腹、耳朵不豎、尾尖呈圓形、掌底膚色為肉色、兩側乳房每對之間的連線都分別與體軸線垂直。也有學者通過對分布于云南、廣西和貴州地區190個中緬樹鼩的頭骨和32顆臼齒的形態特征進行初步研究，結果發現他們的形變多集中在臼齒和鼻骨，這可能與中緬樹鼩棲息的地理環境和氣候有關［6］。上述研究結果說明，不同地區樹鼩群體之間存在顯著差異，通過樹鼩表型多態性能簡便、易行、快速區別種屬甚至亞種，但目前研究的實驗樹鼩大多來自野生群體，表型特征差異不一定都是遺傳變異的真實反映，而且受到外界環境、生活習性等多重因素的影響，因此建立一個遺傳背景清晰的樹鼩品系還必須結合其他的標記技術，進行更深層次的研究。

2 染色體多樣性

作為遺傳物質載體與基因攜帶者，染色體變異可引起遺傳變異的發生。劉瑞清等［7］比較了中國西南部樹鼩的三個亞種染色體特征，結果顯示越北亞種、滇西亞種、瑤山亞種的染色體數目都是62，且G帶與C帶基本相似;核仁銀染區的數目也相同（4～6個），且分布相似。研究表明，三個亞種都為二倍體，亞種之間核型基本上相同，從而為樹鼩的分類鑒定提供了細胞遺傳學依據。我們知道染色體水平上的研究不易受到環境的影響，但是目前染色體的細胞學標記數目和結構變異都非常有限，從而限制了這一技術方法在亞種分類中的應用。

3 蛋白質多樣性

蛋白質相對復雜，而且研究方法相對有限，因此關于樹鼩蛋白質多樣性的研究也相對較少，主要是集中在對其血液成分和同工酶等方面的研究。酶是基因表達的產物，其多肽鏈中的氨基酸序列多由結構基因的核苷酸序列決定，同工酶的產生主要是由于構成酶蛋白亞基的氨基酸組成和順序不同所導致的。同工酶普遍存在于生物界，并呈共顯性，通過電泳技術測定的方法簡易、獲得結果迅速，因此研究起來相對方便。季維智等［8］利用同功酶丙烯酰胺圓盤電泳技術，通過對云南昆明、瑤山和廣西南寧地區樹鼩的乳酸脫氫酶（LDH）同功酶和種群的關系進行了研究，結果提示不同地域的樹鼩LDH同功酶酶譜表現出一定的差異，這與王應祥等對樹鼩形態學分類的研究結果一致，即昆明、南寧和瑤山樹鼩應為三個不同的亞種。雖然同工酶具有相對穩定性，但是多數情況下同工酶水平研究的可靠性均較DNA水平研究低，并且同工酶具有組織特異性，易受發育階段的影響。

4 基因多樣性

作為遺傳多樣性的本質，基因多態性是最直接、最可靠的多態性，它包括了染色體多態性和線粒體DNA（mtDNA）多態性。因此，基因多態性研究主要為核DNA多態性和mtDNA多態性研究。雖然基因信息量大，但研究方法相比蛋白來說具有更多的選擇性，如常用的有直接測序，限制性內切酶片段長度多態性、微衛星DNA標記、單核苷酸多態性（SNP）標記、隨機擴增多態性標記等方法。如楊芳等［9］通過對30 只中緬樹鼩的 Car2、Es3、Akp1、Trf、Ce2、Es1 等 6個酶基因位點進行檢測及計算分析，了解樹鼩遺傳多態性。結果發現 Car2、Es3位點無遺傳多態性，而Es1、Akp1、Trf、Ce2 位點具有遺傳多態性，并且多態性較高。雖然目前關于基因多態性的研究方法比較多，但現在比較成熟及常用的方法主要有微衛星DNA標記、SNP標記、隨機擴增多態性標記等技術，且都是表現出染色體DNA中核苷酸的排列順序變化［10］。

4.1 微衛星DNA多態性 微衛星DNA又稱簡單重復序列，廣泛存在于真核基因組中，指的是在DNA基因組中比10個核苷酸小的簡單重復序列。目前，對樹鼩的基礎生物學方面研究相對比較滯后，對整個基因組上微衛星位點的分布和遺傳特征尚沒有一個系統性的研究和認識。Srikwan等以普通樹鼩為對象，利用微衛星技術篩選出了6個微衛星位點，并對野生樹鼩的種群內多樣性以及種群間的關系進行了研究。隨后，Munshi-South等［11］也篩選出5個微衛星位點，并研究了其遺傳多樣性。何保麗等［12］利用PCR擴增技術對30只中緬樹鼩個體的11個微衛星位點進行了遺傳檢測，結果發現其等位基因數為2～12個不等，雜合度為0.242～0.801，每個位點的多態信息含量范圍為0.198～0.699，平均多態信息為0.518，這在一定程度上說明了在同一地緣和同一種群中，個體間也存在著DNA多態性。然而，這些研究中所使用的技術方法可能對于識別檢測到的微衛星位點多態性存在著一定的判讀誤差。為此，Liu等［13］對中緬樹鼩20個多態性的微衛星基因座擴增，其中只有14個能夠成功擴增，有6個未能擴增出來或者是條帶非特異，隨后便對這成功擴增的14個基因進行測序對比，發現TB9和TB14的重復序列都有一定程度的突變，即AAG變成了GAG。然后再用這14個微衛星基因座對117只中緬樹鼩檢測，發現TB2和TB10無多態性，而剩下的12個基因座不僅具有多態性，同時也表現出較高的期望雜合度，這提示我們在培育純化樹鼩品系時，種群內的個體基因多態性是不能忽略的因素。雖然目前對中緬樹鼩開展了一些研究，但針對亞種、各地理群體間遺傳多態性的比較系統的研究尚缺乏，這將極大地限制對樹鼩遺傳資源的保護和利用，也是今后科研工作中的難點和重點。

4.2 隨機擴增長度多態性（RAPD）RAPD DNA標記也可作為遺傳標記用于樹鼩遺傳多樣性的研究。RAPD具有DNA用量少、技術簡單、不需探針、多態性識別率較高、安全性較好等優點而被廣泛應用于遺傳多樣性的研究［14］。黎嘉敏等［15］先從 40條隨機引物挑選出了20條重復性好和特異性較強的RAPD引物，對從昆明郊區野外捕捉的成年中緬樹鼩進行PCR擴增，結果檢測到的多態位點有69個，多態位點比率達到61.1%。個體間遺傳距離范圍在0.09 ～0.27，遺傳距離平均為 0.169 3，這提示個體之間遺傳差異較大，進一步分析發現有48.29%多態性位點來源于群體內，51.71%來源于雌雄群體間。研究表明，所篩選的隨機引物可有效地用于分析中緬樹鼩種群的遺傳結構，這對于樹鼩種群的保護、利用和選擇育種以及實現樹鼩實驗動物標準化具有十分重要的意義。

4.3 mtDNA多態性 mtDNA是存在于胞內線粒體中的一種遺傳物質。mtDNA因具有高拷貝、母系遺傳的特點，從而被廣泛應用在群體遺傳學和法醫學等研究領域［16］。陳仕毅等［17］分析了80只源于云南昆明周邊地區的野生樹鼩mtDNA多態性，并結合國外報道的2個樹鼩序列比對，發現其具有較高的群體遺傳多樣性。此外，還發現了昆明地區的樹鼩和國外所報道的2個樹鼩間存在較大的遺傳分化。研究結果提示，基于昆明地區樹鼩與國外樹鼩之間存在著較大遺傳差異，說明mtDNA的研究可以用于對樹鼩種群遺傳多樣性的分析。隨后朱萬龍等［18］通過測定祿勸、劍川、麗江3個地區種群的線粒體Cytb基因的全序列與控制區D-loop基因區段，對Cytb基因的檢測發現了47個多態性位點，其中有24個簡約信息位點，23個單變異位點，進一步分析發現祿勸、劍川、麗江3個地域的中緬樹鼩種群內遺傳距離分別是0～1.7%、0 ～1.2%、0 ～1.1%;而這3 個地區樹鼩種群間的遺傳距離分別是0.1% ～1.9%（祿勸—麗江）、0.1% ～1.9%（祿勸—劍川）、0 ～1.2%（劍川—麗江）。對D-loop基因檢測發現有21個多態性位點，其中簡約信息位點和單變異位點分別有11、10個，種群內遺傳距離分別是 0 ～1.1%（祿勸）、0.3% ～1.4%（麗江）;樹鼩種群間的遺傳距離分別是0.3% ～1.4%（祿勸—麗江）、0.5% ～1.2%（祿勸—劍川）、0.1% ～1.1%（劍川—麗江）。進一步數據分析得出，3個地區的中緬樹鼩明顯可分為兩支，一支全是祿勸種群，另一支基本上是劍川—麗江種群（除1個為祿勸單倍型）。此外，通過進化網絡關系推測祿勸種群更接近祖先種，而橫斷山種群（劍川、麗江種群）可能是祿勸種群改變而來，且因橫斷山地區特殊的生態環境使其擁有的遺傳多樣性更高，實驗結果同時提示中緬樹鼩可能出現由南向北的擴散模式。

上述DNA分子標記都是以個體間核苷酸序列差異為基礎的遺傳標記。DNA多樣性研究具有數量多、高度多態、呈共顯性遺傳等優點，但是目前尚沒有一種DNA分子標記技術是令人十分滿意的，仍需要進一步地探索出重復性好、可靠性高、操作簡易的分子標記技術［19］。

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