研究新輔助化療后口腔頜面-頭頸鱗癌組織中Omi/HtrA2的表達及作用

耿樂樂 陳彥平

腫瘤的發生發展不僅與細胞增殖有關，亦與細胞凋亡有關，而后者的作用更為重要，化學藥物和放療殺死腫瘤細胞都是通過誘導細胞凋亡來完成的。促凋亡蛋白—Omi/HtrA2位于線粒體膜間隙，在凋亡誘導因子的作用下，Omi/HtrA2被釋放到細胞液中，通過caspase途徑和非 caspase依賴途徑引起細胞凋亡［1，2］。本實驗中，我們應用RT-PCR和免疫組化的方法檢測經新輔助化療藥物——奈達鉑干預的前后口腔頜面頭頸鱗癌(鱗癌)組織和鱗癌癌旁組織中Omi/HtrA2表達的情況，判斷奈達鉑在其中的作用，以期為應用新輔助化療提高口腔頜面頭頸鱗癌控制率及生存率提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年3月至2013年8月于河北醫科大學第四醫院口腔科就診患者45例，術前取病理已確診為鱗狀細胞癌(部分低分化鱗癌進行了免疫組化確診)，其中高分化者36例，低分化者9例;45例鱗癌患者標本分鱗癌組(術前)、鱗癌組(術后)、鱗癌癌旁(距瘤緣2 cm)組(術前)、鱗癌癌旁組(術后)，以上4組標本均為術后即刻取材，分為兩份，一份應用4%甲醛固定，另一份放于－80°低溫冰箱編號保存。

1.2 實驗試劑 Omi/HtrA2鼠抗人單克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，Maxvision2/HRP免疫組化染色試劑盒購自福州邁新生物技術有限公司，Omi/HtrA2及β-actin引物購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，RT-PCR試劑盒及1 500 bp DNAmarker購自美國Promega。

1.3 方法

1.3.1 RT-PCR檢測mRNA表達變化:將標本組織勻漿后按Triizol試劑盒提供的操作步驟提取總RNA，－80℃保存。應用Promega公司的逆轉錄試劑盒合成cDNA，操作按試劑盒說明書進行。據GenBank中登錄的Omi/HtrA2基因序列，設計引物。上游引物為5’-GACCGGCACCTTTCTTG-3’，下 游 引 物 為 5’-GCCCCCACTGGTTCATTT-3’;β-actin 內參上游引物為5’-CTGTTCCAGCCTTCCTTC-3’，下游引物為 5’-TCCTGCTTGCTAATCCAC-3’。每20微升反應體系包含cDNA 1 μl，上游引物 1 μl，下游引物 1 μl，Nuclease-Free Water 7 μl，Gen Green 10 μl。PCR 步驟:94℃ 預變性5 min，94℃變性 60 s ，52℃ 退火 60 s，72℃ 延伸60 s，共35個循環，72℃末次循環延伸7 min。擴增產物電泳，以β-actin基因作為擴增產物的參照，采用gel-proanalysis 3.1軟件進行掃描觀察結果，并記錄結果。

1.3.2 免疫組織化學檢測各組Omi/HtrA2的表達水平:標本經常規10%甲醛固定，石蠟包埋，將厚度定為4 μm，石蠟切片機連續切割各組石蠟包埋的組織，所得各組切片常規脫蠟。Maxvision2/HRP一步法行Omi/HtrA2免疫組化染色，Omi/HtrA2一抗的抗體濃度為1∶200，以PBS為陰性對照的一抗，已知陽性標本為陽性對照。

在光學顯微鏡下觀察，胞漿中有棕黃色顆粒為Omi/HtrA2染色陽性。在一張切片中，隨機觀察5個高倍視野(×40)，數每100個細胞中陽性細胞的個數，計算平均值。①以陽性細胞百分比計分:＜5%為0分;5% ～25%為1分;26% ～50%為2分;51%-75%為3分;＞75%為4分。②以陽性細胞染色強度計分:未著色為0分;淡黃色為1分;棕黃色為2分;棕褐色為3分。①和②分值相加為總分，分級:0～1分為(－);2～3分為(+);4～5分為(++);6～7分為(+++)。低表達:(－)、(+)，高表達:(++)、(+++)。

1.4 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以表示，采用重復測量的方差分析，計數資料采用χ2檢驗和SNK兩兩比較法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 mRNA表達 奈達鉑干預前高分化鱗癌組、低分化鱗癌組、鱗癌癌旁組織組中Omi/HtrA2的灰度值依次遞減，分別為 0.8126 ± 0.1249、0.4627 ± 0.1123、0.3761 ±0.1526，Omi/HtrA2mRNA 在三種組織中的表達量差異有統計學意義(P＜0.05)，SNK法兩兩比較表明，高分化鱗癌組中的表達高于低分化鱗癌組織、鱗癌癌旁組織，差異有統計學意義(P＜0.05)。奈達鉑干預后3組中Omi/HtrA2mRNA的灰度值分別為1.3553 ± 0.1614、0.6718 ±0.1421、0.4350 ± 0.1172，SNK法兩兩比較表明，高分化鱗癌組中的表達高于低分化鱗癌組織、鱗癌癌旁組織，差異有統計學意義(P＜0.05)。比較 3組奈達鉑干預前后 Omi/HtrA2mRNA的表達量，發現藥物干預后 Omi/HtrA2mRNA的表達量高于藥物干預前，差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖1，表1。

圖1 Omi/HtrA2在不同組織中的mRNA表達情況

表1 Omi/HtrA2在不同組中mRNA的表達情況±s

表1 Omi/HtrA2在不同組中mRNA的表達情況±s

注:與高分化鱗癌比較，*P ＜0.05;與干預前比較，#P ＜0.05

組織樣本 干預前灰度值 干預后灰度值高分化鱗癌(n=36) 0.8126 ±0.1249 1.3553 ±0.1614#低分化鱗癌(n=9) 0.4627 ±0.1123* 0.6718 ±0.1421*#癌旁組織(n=45) 0.3761 ±0.1526* 0.4350 ±0.1172*#

2.2 Omi/HtrA2蛋白的表達情況 在鱗癌組織細胞及鱗癌癌旁組織細胞中的免疫細胞化學染色均有陽性表達出現，DAB棕黃色顆粒著色在胞漿中。奈達鉑干預前高分化鱗癌組、低分化鱗癌組、鱗癌癌旁組織組中Omi/HtrA2陽性表達率分別為 66.7%(24/36)、55.6%(5/9)、13.3%(6/45)，SNK 法兩兩比較表明，高分化鱗癌組中的表達高于低分化鱗癌組織、鱗癌癌旁組織，差異有統計學意義(P＜0.05)。用藥后3組Omi/HtrA2陽性表達率分別為 88.9%(32/36)、66.7%(6/9)、42.2%(19/45)，SNK 法兩兩比較表明，高分化鱗癌組中的表達高于低分化鱗癌組織、鱗癌癌旁組織，差異有統計學意義(P＜0.05)。分別比較奈達鉑干預前后3組間的差異，藥物干預后各組中的表達情況大于藥物干預前各組中的表達，差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖 2，表 2。

圖2 Omi/HtrA2蛋白在不同組中的表達情況(SP×400)

表2 Omi/HtrA2在不同組中的蛋白表達n=45，例

3 討論

細胞凋亡參與了腫瘤的起始過程，并對腫瘤的發生起負調控作用。有研究發現，癌前病灶中細胞凋亡率比周圍正常組織高出約8倍，提示由于轉化后細胞分裂周期變短，機體需要通過細胞凋亡機制及時地加以清除。隨著人們對Omi/HtrA2研究的逐步深入，其作為一種重要的具有蛋白酶活性的致凋亡分子，學者們對其在腫瘤發生發展中的作用也做了一定的探索，發現在肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、喉癌、前列腺癌、胰腺癌和食管癌中均有 Omi/HtrA2高表達，推測 Omi/HtrA2與腫瘤發生發展有密切關系。此外，還有學者認為Omi/HtrA2可提高細胞對順鉑的敏感性，促進凋亡過程的發生［3］，亦有研究認為可以通過刺激Omi/HtrA2的活動從而導致細胞凋亡的發生［4］。

本實驗結果顯示經奈達鉑干預后的各組中，尤其是高分化鱗癌組，Omi/HtrA2的表達較未經奈達鉑干預的鱗癌組織中的表達明顯增高，這與一些研究順鉑應用后增加細胞凋亡活動的結論相一致，推測Omi/HtrA2可增強細胞對化療藥物的敏感性。此外，鱗癌癌旁組及低分化鱗癌組經奈達鉑處理后Omi/HtrA2表達亦有所增高，考慮奈達鉑可誘導細胞凋亡的發生。而對于低分化鱗癌組中Omi/HtrA2為低表達或不表達，推測低分化鱗癌組織中通過對躲避致凋亡因子，使Omi/HtrA2沉默，并聯合其他機制，從而減少其凋亡，形成其惡性程度高、侵襲性強、轉移率高的能力。對于癌旁組織中Omi/HtrA2的高表達，推測組織病變發生到一定程度即可具有激活凋亡因子的能力，促使Omi/HtrA2的表達，這需要對收集更多類型及樣本量的病變組織進行研究。

新輔助化療的應用可使最終手術治療和(或)放療時的病變組織縮小，盡可能地減少器官的形態缺失和功能破壞，從而提高了病患的生存質量［5－7］。化療藥物在放療過程中發揮了增敏劑的效用，二者結合使局部組織的治療密度增加，并且對局部病灶的控制也有很好的效果，但有研究表明誘導化療對病灶的遠處轉移有更好的治療的效果［8－11］。根據本實驗結果，我們推斷以奈達鉑為例的新輔助化療藥物可以增加鱗癌組織中的細胞凋亡過程，從而提高其對癌組織控制率，新輔助化療對口腔頜面頭頸鱗癌的干預有效，在分子水平上為誘導化療治療口腔頜面頭頸鱗癌提供證據。

在腫瘤治療中很多抗癌藥物和放射療法的目標是誘導腫瘤細胞發生凋亡，而腫瘤細胞凋亡信號通路的障礙是導致相關療法效果不理想的重要原因，故欲提高化、放療的效果需著眼于糾正腫瘤細胞凋亡機制的異常。腫瘤細胞對治療的抵抗性與其凋亡程序的異常相關，能否成功地清除腫瘤細胞，在很大程度上依賴于治療方法能否有效激活沉默的或被抑制了的凋亡途徑。余丹等［4］經實驗研究認為，通過干預Omi/HtrA2來阻斷P53誘導凋亡中的Omi/HtrA2對XIAP的抑制作用，可達到抑制肝癌細胞的目的，為肝癌治療提供了新的靶點。根據實驗結果，我們推測如果在腫瘤組織中使Omi/HtrA2大量激活，進而增強機體對化療藥物的敏感性，促進細胞凋亡，縮小病灶組織，減少器官形態缺失以及功能破壞，可達到治療腫瘤的目的;并且減少了化療藥物的劑量，從而減少不良反應的發生，提高患者的生活質量，為化療藥物治療惡性腫瘤提供了新思路。

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3 Pruefer FG，Lizarraga F，Maldonado V，et al.Participation of Omi Htra2 Serine-Protease Activity in the Apoptosis Induced by Cisplatin on SW480 Colon Cancer Cells.Journal of Chemotherapy，2008，20:348-354.

4 余丹，林菊生，孫昕，等.Omi/HtrA2對人肝癌細胞系凋亡的調控作用研究.胃腸病學和肝病學雜志，2009，18:224-227.

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