甲狀腺癌患者血清let-7e、miR-142表達及其與Th17/Treg的相關性分析

周偉清，莊一心，沈衛星，沈育鋒，章平

甲狀腺癌是內分泌系統的常見惡性腫瘤，女性發病率遠高于男性。大多數甲狀腺癌患者預后良好，治療后生存率高，但部分未分化癌預后極差。雖然關于甲狀腺癌影響因素研究較多，但由于近年來人們飲食結構、生活環境惡化、遺傳、肥胖等因素影響，甲狀腺癌發病率逐年上升，嚴重影響人類生存質量[1]。因此繼續探尋甲狀腺癌進展中相關因子及指標仍有重要意義。Shan等[2]研究發現，結直腸癌組織中let-7e顯著低于癌旁組織，可能與結直腸癌進展有關，下調let-7e可促進癌細胞增殖、侵襲、體外血管生成和腫瘤生長。有研究表明，let-7e在非小細胞肺癌中表達下調，可能與患者生存率有關[3]。miR-142在肝癌組織中低表達，過表達miR-142可明顯誘導癌細胞凋亡。胡潺潺等[4]研究報道，乳腺癌組織和細胞中miR-142表達下調，與癌細胞侵襲性有關，上調miR-142表達可抑制癌細胞侵襲和遷移[5]。由于輔助性T細胞17(T helper cell 17，Th17)/調節性T細胞(regulatory T cell，Treg)水平與腫瘤進展有關，且甲狀腺癌中let-7e、miR-142表達水平及與Th17/Treg關系未見報道，因此本研究通過檢測甲狀腺癌患者血清let-7e、miR-142表達水平及患者外周血Th17/Treg水平，分析let-7e、miR-142表達與Th17/Treg水平關系，以期為甲狀腺癌患者臨床治療和預后改善提供一定理論依據，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年5月—2019年6月復旦大學附屬中山醫院青浦分院普外科收治的甲狀腺癌患者(甲狀腺癌組)109例，其中男41例，女68例，年齡28～65(47.25±9.87)歲。納入標準：(1)經臨床及病理組織切片檢查確診為甲狀腺癌；(2)患者入組前未進行任何治療；(3)臨床資料完整。排除標準：(1)合并患有其他部位腫瘤者；(2)心臟、腎臟、肝臟等功能嚴重不全者；(3)患有嚴重精神疾病者。根據美國癌癥聯合會TNM分期系統[6]將入組患者分為：Ⅰ～Ⅱ期56例，Ⅲ期53例；根據病理分型分為：乳頭狀癌83例，濾泡型癌10例，未分化癌9例，髓樣癌7例；根據是否有淋巴結轉移分為：無淋巴結轉移39例，有淋巴結轉移70例。另選取同期在醫院健康體檢者109例作為健康對照組，其中男43例，女66例；年齡29～63(48.03±8.96)歲。2組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準，受試者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器 (1)主要試劑：總RNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)；反轉錄試劑盒(美國Thermo公司)；實時熒光定量(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)試劑盒(日本Takara公司)。主要儀器：qRT-PCR儀(ABI 7500，美國ABI公司)；流式細胞儀(CytoFLEX，美國貝克曼庫爾特有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣本采集： 甲狀腺癌組患者和健康對照組分別于入組后和體檢時(07∶00～09∶00)空腹采集外周靜脈血5 ml，3 ml在4℃、3 000 r/min條件下離心15 min，用于qRT-PCR和ELISA試驗，2 ml用于流式細胞術檢測。

1.3.2 血清let-7e、miR-142表達水平檢測： 使用Trizol法提取總RNA，反轉錄后得到cDNA，進行qRT-PCR試驗。20 μl反應體系如下，10 μl SYBR2Taq Ⅱ，2 μl cDNA，0.4 μl ROX，0.8 μl上游引物，0.8 μl下游引物，ddH2O 6.0 μl。qRT-PCR反應步驟如下，95℃、35 s，1循環；95℃、5 s；63℃、34 s，38循環。每個樣本重復3次，用2-△△CT法計算let-7e、miR-142表達水平，所用引物見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 流式細胞術檢測Th17及Treg細胞水平: 取入組者外周血5 ml，加入PBS緩沖液混勻后滴入裝有10 ml ficoll分離液離心管中，離心后取中層單個核細胞，顯微鏡下計數。將所得單個核細胞稀釋到相應濃度后于細胞培養箱培養4 h。收集培養后細胞，分成2份，分別加入相應單抗，用流式細胞儀進行檢測，嚴格按照說明書進行操作。以CD4+IL-17+在CD4+T細胞中百分比表示Th17水平，CD4+CD25+Foxp3+細胞在CD4+T細胞中百分比表示Treg細胞水平。

1.3.4 血清相關細胞因子水平檢測: 采用ELISA法檢測白介素10(IL-10)、白介素17(IL-17)、白介素23(IL-23)、白介素6(IL-6)及轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，試劑盒購自上海群己生物科技有限公司。

2 結 果

2.1 2組血清中let-7e、miR-142表達水平比較 甲狀腺癌組患者血清中let-7e、miR-142表達水平均顯著低于健康對照組(P均<0.01)，見表2。

表2 2組受試者let-7e、miR-142表達水平比較

2.2 2組外周血Th17、Treg細胞比例比較 甲狀腺癌組患者外周血Th17細胞比例、Treg細胞比例及Th17/Treg均顯著高于健康對照組(P均<0.01)，見表3。

表3 2組受試者Th17、Treg細胞比例比較

2.3 血清let-7e、miR-142及外周血Th17/Treg與甲狀腺癌患者臨床病理特征的關系 let-7e、miR-142及Th17/Treg水平與甲狀腺癌患者性別、年齡、腫瘤直徑和病理分型無關(P均>0.05)，與TNM分期和淋巴結轉移有關(P均<0.01)，見表4。

2.4 2組血清Th17、Treg細胞相關細胞因子水平比較 甲狀腺癌患者血清IL-10、IL-17、IL-23、IL-6及TGF-β水平顯著高于健康對照組(P均<0.01)，見表5。

2.5 甲狀腺癌患者let-7e、miR-142表達與Th17/Treg水平相關性分析 甲狀腺癌患者血清let-7e表達水平與外周血Th17/Treg水平呈負相關(r=-0.337，P=0.000)，血清miR-142表達水平與外周血Th17/Treg水平呈負相關(r=-0.402，P=0.000)，見圖1、圖2。

2.6 甲狀腺癌患者血清let-7e、miR-142表達與細胞因子相關性分析 甲狀腺癌患者血清let-7e、miR-142表達水平與IL-6無關(P>0.05)，與IL-10、IL-17、IL-23及TGF-β水平均呈負相關(P均<0.01)，見表6。

表4 let-7e、miR-142及Th17/Treg水平與甲狀腺癌患者臨床病理特征的關系

表5 2組血清Th17、Treg細胞相關細胞因子水平比較

圖1 甲狀腺癌患者let-7e與Th17/Treg水平相關性

圖2 甲狀腺癌患者miR-142與Th17/Treg水平相關性

表6 甲狀腺癌患者血清let-7e、miR-142表達與細胞因子相關性分析

細胞因子let-7er值P值miR-142r值P值IL-10-0.4350.000-0.5070.000IL-17-0.3270.001-0.4040.000IL-23-0.3920.000-0.4530.000IL-6-0.2010.087-0.2130.076TG-β-0.3760.000-0.4270.000

3 討 論

甲狀腺癌早期表現為頸部甲狀腺出現非對稱性腫塊、咽喉有壓抑感、頸部疼痛等，但由于早期癥狀無典型性特征，甲狀腺癌易進展至中晚期。中晚期甲狀腺癌患者出現呼吸不暢、吞咽困難、頸部放射痛、淋巴結腫大、轉移至其他部位引起其他器官病變，嚴重威脅患者生存[7]。甲狀腺癌發生發展中相關影響因子仍是甲狀腺癌研究重要部分。微小RNA(micro RNA，miRNA)是一類短鏈非編碼RNA，能參與多種疾病調控。研究表明，miR-126-3p在甲狀腺癌組織中表達水平顯著低于癌旁組織，上調其表達可抑制癌細胞增殖、遷移和侵襲，促進凋亡[8]。Bai等[9]研究發現，miR-150在甲狀腺癌組織中明顯下調，體外過表達可誘導癌細胞周期阻滯，提示多種miRNA可參與調控甲狀腺癌進展。

有研究報道，miRNA家族成員let-7e在上皮性卵巢癌中低表達，與患者無進展生存率較差有關[10]。本研究結果中，甲狀腺癌患者血清let-7e表達水平顯著低于健康對照組，與Xiao等[10]研究結果相似，提示患者血清中let-7e表達水平可能與甲狀腺癌發生有關。Gong等[11]研究發現，let-7e在膠質母細胞瘤組織中表達低于正常腦組織，let-7e可通過抑制細胞增殖、侵襲、遷移和促進細胞凋亡，抑制腫瘤進展。本研究結果顯示，甲狀腺癌患者血清let-7e表達水平與TNM分期和淋巴結轉移有關，提示let-7水平可能與甲狀腺癌發展有關。

Lu等[12]研究發現，胰腺癌組織和細胞系中miR-142表達顯著下調，參與胰腺癌細胞增殖和侵襲調控。研究表明，miR-142在食管鱗癌組織中明顯低于癌旁組織，與淋巴結轉移、臨床分期及患者預后有關[13]。另有研究報道，miR-142在胃癌組織中低表達，可抑制癌細胞遷移和侵襲，與患者復發等不良預后有關[14]。本研究結果顯示，與健康對照組相比，甲狀腺癌患者血清miR-142表達水平顯著降低，與Yan等[14]在胃癌中研究結果一致。進一步分析發現，miR-142表達與甲狀腺癌患者TNM分期和淋巴結轉移有關，提示miR-142可能參與甲狀腺癌進展。

Th17細胞能分泌IL-17，通過促進炎性反應參與機體免疫系統調控。有研究發現，非小細胞肺癌患者外周血Th17細胞比例顯著高于健康對照組，與非小細胞肺癌臨床分期有關[15]。本研究結果顯示，甲狀腺癌患者外周血Th17細胞比例顯著高于健康對照組，提示外周血Th17細胞比例升高可能與甲狀腺癌發展有關。Treg細胞能維持機體免疫耐受，通過抑制免疫反應維持免疫系統平衡。研究表明，非小細胞肺癌組織中Treg浸潤明顯高于癌旁組織，與TNM分期和淋巴結轉移有關[16]。本研究結果中，甲狀腺癌患者外周血Treg細胞比例顯著升高，提示外周血Treg細胞比例異常可能影響甲狀腺癌發生發展。另外，研究報道，與健康對照組相比，非小細胞肺癌患者Th17/Treg比值明顯升高，可能影響癌細胞分化[17]。李清靖等[18]發現，胃癌患者外周血Th17/Treg明顯升高，與TNM分期、分化程度、淋巴結轉移有關。本研究結果顯示，甲狀腺癌患者外周血Th17/Treg比值明顯高于健康對照組，且與TNM分期、發生淋巴結轉移有關，提示甲狀腺癌患者體內Th17/Treg平衡被打破，可能影響甲狀腺癌發生發展。

Navarro等[19]研究表明，Th17細胞因子IL-17可調控乳腺癌細胞增殖和遷移，可能與腫瘤進展及患者預后有關。Th17可通過調控IL-23及IL-6促進結腸癌及大腸癌進展[20-21]。劉勇等[22]發現，Treg細胞與TGF-β、IL-10水平呈正相關，共同參與肝癌患者體內免疫調控過程。本研究結果顯示，甲狀腺癌患者血清中與Th17/Treg相關因子IL-10、IL-17、IL-23、IL-6及TGF-β水平顯著升高，提示Th17/Treg比例失衡可能導致相關因子水平異常，影響甲狀腺癌發生發展。進一步研究發現，甲狀腺癌患者血清let-7e、miR-142表達水平與外周血Th17/Treg水平及其相關因子IL-10、IL-17、IL-23、TGF-β水平呈負相關，提示let-7e、miR-142可能通過調控Th17/Treg比值影響相關細胞因子水平，在甲狀腺癌進展中發揮作用。

綜上所述，與健康對照組相比，甲狀腺癌患者血清let-7e與miR-142表達水平下調，Th17/Treg水平上調，與患者TNM分期及淋巴結轉移有關，且血清let-7e、miR-142表達水平與Th17/Treg及其相關因子水平均呈負相關，提示let-7e、miR-142與Th17/Treg之間可能存在調控機制，共同參與甲狀腺癌發生發展。但由于本研究樣本量較少、研究方法較為單一，具體作用機制尚需進一步深入研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

周偉清：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；莊一心：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；沈衛星：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；沈育鋒：進行統計學分析；章平：課題設計，論文撰寫