白血病患者ID4、hMLH1、CDX2基因啟動子區異常甲基化及mRNA表達分析

韓松，侯志新，劉承祥，張雷，鄭偉

DNA甲基化是指在不改變DNA序列的前提下，改變遺傳表現的一種DNA化學修飾形式。DNA結合抑制因子4(DNA binding inhibitor 4, ID4)是一種新的抑癌因子，可調節細胞分化，在細胞繁殖前后和細胞周期發展中起作用。有研究表明，骨髓增生異常綜合征患者ID4基因甲基化與惡性腫瘤復發及轉移有關[1]。人類Mut L同源物1(human Mut L homolog 1, hMLH1)是DNA錯配修復系統(mismatch repair system, MMR)中的重要基因，hMLH1基因啟動子區異常甲基化可導致MMR失活，且hMLH1基因mRNA的表達及功能缺失與多種腫瘤的發生發展有關。尾型同源盒轉錄因子2(caudal-type homeobox transcription factor 2,CDX2)是一種轉錄因子，CDX2基因mRNA表達的失調與腫瘤的發生發展密切相關，在膀胱癌中CDX2基因mRNA呈高表達[2-3]。為研究ID4、hMLH1、CDX2表達是否受到基因啟動子區甲基化影響，本研究分析白血病患者ID4、hMLH1、CDX2基因啟動子區異常甲基化及mRNA表達情況，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年1月—2019年3月中國人民解放軍聯勤保障部隊第九六四醫院確診的白血病患者90例作為研究組，按照白血病類型分為急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)38例，慢性粒細胞白血病(chronic myelocytic leukemia, CML)24例，急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)28例； AML男27例，女11例；年齡16～52(35.17±11.25)歲。CML男16例，女8例；年齡17～48(33.35±11.27)歲。ALL男20例，女8例；年齡20～50(34.73±10.83)歲。選取同期健康志愿者30例作為健康對照組，男20例，女10例；年齡22～49(34.39±9.54)歲。2組性別、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準，受試者及家屬知情同意并簽署同意書。

1.2 選擇標準 (1)納入標準：①經臨床確診為白血病，且均符合法、美、英分型系統(French-American-British classification systems)[4]的診斷和分型標準；②年齡16～52歲。(2)排除標準：①嚴重肝、腎功能不全者；②其他嚴重惡性腫瘤影響本研究者。

1.3 試驗方法 收集受試者抗凝骨髓液2～5 ml，采用淋巴細胞分離液分離單個核細胞，保存于-80℃進行基因組提取。

1.3.1 ID4、hMLH1、CDX2基因啟動子區甲基化檢測： 取1×106個單個核細胞提取總RNA，采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(methylation-specific polymerase chain reaction, MS-PCR)檢測 ，DNA/RNA抽提試劑盒、PCR引物購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。(1)ID4反應條件，94℃ 4 min，94℃ 30 s，45℃ 30 s，72℃ 30 s ，此為1個循環，共進行30個循環，再在72℃條件下進行7 min的延展。ID4甲基化特異性上游引物為5'-TTTTATAAATATAGTTGCGCGGC-3'，下游引物為5'-GAATATCCTAATCACTC-CCTTCGA-3'。(2)hMLH1反應條件，94℃ 4 min，94℃ 45 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，此為1個循環，共進行40個循環，再在72℃條件下進行7 min的延展。hMLH1甲基化特異性上游引物為5'-ACGTAGACGTTTTATTAGGGTCGC-3'，下游引物為5 '-CCTCATCGTAACTACCCGCG-3'。(3)CDX2反應條件，94℃ 5 min，94℃ 30 s，45℃ 30 s，72℃ 45 s，此為1個循環，共進行30個循環，再在72℃條件下進行7 min的延展。CDX2甲基化特異性上游引物為5'-CGAAAATAAAAATCACTACGACG-3'、下游引物為5'-ATTCAAAAATAAAAATCACTACAACA-3'。

1.3.2 ID4、hMLH1、CDX2基因mRNA表達水平檢測： 采用逆轉錄—聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測，人CML細胞株K562、AML細胞株HL-60購自上海繼和生物科技有限公司，RT逆轉錄試劑盒購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。①ID4反應條件，94℃ 4 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s，此為1個循環，共進行40個循環，再在72℃條件下進行7 min的延展。ID4上游引物為5'-TCACTGCGCTCAACACCGACCC-3'，下游引物為5'-TTCCCCCTCCCTCTCTAGTGCTCCTG-3'。②hMLH1反應條件，94℃ 4 min，94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，此為1個循環，共進行30個循環，再在72℃條件下進行7 min的延展。hMLH1上游引物為5'-CGGTTACTACCCAATGCCTCAACG-3'，下游引物為5'-TTCTCGACTAACAGCATTTCCAA-3'。③CDX2反應條件，94℃ 5 min，94℃ 30 s，49℃ 30 s，72℃ 45 s，此為1個循環，共進行30個循環，再在72℃條件下進行8 min的延展。CDX2上游引物為5'-AAAGGATATTGGAGAGTATTTTAG-3'，下游引物為5'-CATAGTCCTGGATTTCGTCA-3'。

2 結 果

2.1 2組ID4、hMLH1、CDX2基因啟動子區異常甲基化比較 AML、CML、ALL患者的ID4 、hMLH1基因甲基化發生率均高于健康對照組(P<0.01)，而CDX2基因甲基化與健康對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 2組受試者ID4、hMLH1、CDX2基因啟動子區異常甲基化比較 [例(%)]

2.2 2組ID4、hMLH1、CDX2基因mRNA表達比較 與健康對照組比較，AML、CML、ALL患者的ID4、hMLH1基因mRNA表達較低，而CDX2基因mRNA表達較高，差異均有統計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 2組受試者ID4、hMLH1、CDX2基因mRNA表達比較

3 討 論

白血病是一類造血干細胞惡性克隆性疾病，其發生與表觀遺傳和細胞遺傳的改變有關。文獻研究表明，腫瘤的發生發展與表觀遺傳中的CpG島甲基化異常有關[5-7]。DNA甲基化是DNA的天然修飾方式，其過程為DNA甲基轉移酶催化甲基供體，使胞嘧啶轉變為5甲基胞嘧啶，可參與基因的調控、表達及細胞的增生、調節和分化。吳明彩等[8]研究表明，染色質域解旋酶DNA結合蛋白5(chromodomain helicase DNA binding protein 5,CHD5)基因異常甲基化影響其表達，可促進AML的發生。本研究采用MS-PCR、RT-PCR對AML、CML、ALL患者及健康志愿者的ID4、hMLH1、CDX2基因啟動子區異常甲基化及mRNA表達進行分析，旨在研究白血病的分子發病機制，為白血病的防治提供輔助參考。

ID4基因位于染色體6p22.3-p23區域，是白血病的抑癌基因。ID4基因由于缺乏富含堿性氨基酸的DNA結合域，因此其Id蛋白不能夠與DNA結合，但可與堿性HLH蛋白(basic helix-loop-helix, bHLH)結合，從而抑制bHLH與DNA結合，調控相關基因轉錄[9-10]。有研究表明，ID4基因與腫瘤侵襲、腫瘤血管形成有關，在白血病中呈高度甲基化[11]。本研究結果顯示，AML、CML、ALL患者的ID4基因甲基化異常升高；AML、CML、ALL患者的ID4基因mRNA表達異常降低。結果證明ID4基因的異常甲基化在白血病的發生中起著重要作用，可影響ID4基因mRNA表達，并作為疾病診斷和預后評估的輔助方法。劉菲等[12]研究表明，在AML患者中ID4基因呈高頻甲基化，發生率約為80%，在健康人體中未發現ID4基因異常甲基化。崔桂榮等[13]研究表明，AML、CML、ALL患者ID4基因異常甲基化分別為73.5%、76.2%、84.0%，健康對照組為3.3%，且AML、CML、ALL患者的ID4基因mRNA表達均明顯低于健康對照組，與本研究結果相吻合。

hMLH1基因位于染色體3p21-23區域，是MMR系統的關鍵基因，是最早發現的錯配修復基因之一，可識別堿基錯配部分，啟動錯配修復途徑，其啟動子區異常甲基化可影響基因的表達及功能。多數研究證實，在血液系統腫瘤、實體性腫瘤中會發生hMLH1甲基化[14]。本研究結果顯示，AML、CML、ALL患者hMLH1基因甲基化異明顯升高，hMLH1基因mRNA表達明顯下降。結果證明hMLH1基因的異常甲基化在白血病的發生中起著重要作用，可影響hMLH1基因mRNA表達，并作為疾病診斷和預后評估的輔助方法。張啟弘等[15]研究表明，甲狀腺乳頭狀癌(PTC)患者的hMLH1基因mRNA呈高表達，hMLH1基因的mRNA表達與疾病的發生發展有關。鄒菁等[16]研究表明，AML患者的hMLH1基因mRNA表達受到基因啟動子區甲基化的影響，且hMLH1基因甲基化與白血病的發生發展有關，與本研究結果相似。

CDX2基因由3個外顯子和2個內含子構成，可以編碼核轉錄因子，在正常組織中具有促進細胞的作用，是控制造血系統早期發育的主要基因[17-18]。本研究結果顯示， AML、CML、ALL患者的CDX2基因甲基化均無明顯變化；AML、CML、ALL患者的CDX2基因mRNA表達明顯升高。結果證明白血病患者CDX2基因的異常甲基化沒有下調，可能是其他途徑上調了CDX2基因mRNA表達。申淑珍等[19]研究表明，CDX2基因mRNA表達可反映患者的白血病細胞負荷，是評估預后的重要指標。王巍等[20]研究表明， AML、ALL與健康對照組的CDX2基因異常甲基化均為100%，無明顯差異，且CDX2基因異常甲基化與CDX2基因的mRNA表達無明顯相關性，與本研究結果相吻合。

綜上所述，白血病患者ID4、hMLH1、CDX2基因啟動子區異常甲基化與白血病的發病機制密切相關，ID4、hMLH1基因的mRNA表達受到甲基化的影響，CDX2基因的mRNA表達與甲基化無關。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

韓松：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；侯志新：提出研究思路，分析試驗數據;劉承祥：實施研究過程，資料搜集整理;張雷：進行統計學分析;鄭偉 ：課題設計，論文修改，論文審核