生物樣本庫RNA質量控制的方法學驗證

阮亮亮，鄭培永，楊佳泓，范錦立，甘榮興

生物樣本庫RNA質量控制的方法學驗證

阮亮亮，鄭培永，楊佳泓，范錦立，甘榮興

目的對現有的RNA樣本質量控制的方法進行方法學驗證。方法RNA樣本質量控制往往關注濃度、純度和完整度3個參數，其中前兩者可以用光密度(optical density，OD)260和OD260/280來表征，后者可以用RNA完整度(RNA integrity number，RIN)值來衡量。由于OD260/280對于RNA純度的評價尚無明確標準，故僅對RNA的濃度和完整度展開探討。按照ISO/IEC 17025∶2005的要求，從精密度、準確度和線性3個方面，對RNA定量進行方法學驗證。由于缺乏測量RIN值測定的標準品，RNA完整度的方法學驗證僅限于精密度的考察。結果選用的微量紫外分光光度法對RNA標準品進行定量，精密度、準確度和線性均達到要求；Agilent 2100的RIN值系統對人Hela細胞來源的總RNA進行了評價，RIN值的精密度也通過了考察。結論微量紫外分光光度法和Agilent 2100的RIN值系統可以作為RNA樣本質量控制的方法。

質量管理體系；方法學驗證；精密度；準確度；線性

為了提供高質量的生物樣本及相關信息，生物樣本庫已經成為連接臨床實踐和基礎研究的橋梁[1]。生物樣本庫作為專業性的基礎設施，需要建立一整套良好的操作流程來管理人類樣本資源，這在全球范圍內已達成共識。標準化和協調一致，是生物樣本庫組織的主旋律[2]。

2008年，法國標準化協會出臺了NF S 96-9000，這是第1個專門針對生物樣本庫的質量標準[3]。該質量標準建立在經濟合作與發展組織的推薦規范和ISO 9001∶2000的基礎之上。至今為止，還沒有特異性針對生物樣本庫的國際公認的標準。盡管如此，可供生物樣本庫參考的國際文件層出不窮。如美國病理學家協會發布的樣本庫認可項目，生物與環境樣本庫協會(International Society for Biological and Environmental Repositories，ISBER)發布的《2012樣本庫最佳實踐規范》(2012BestPracticesforRepo-sitories)，ISO 9001∶2000、ISO/IEC 17025∶2005和ISO Guide 34∶2000[4]。上海醫藥臨床研究中心接受上海市科學委員會委托，建設上海市生物樣本庫網絡模型[5]；同樣，中心也發布了自己的最佳實踐規范，包括幾百項標準操作規程和生物分析方法。

從生物樣本中提取RNA，如全血、白膜層，仍然被認為是下游分析方法的必要前導環節之一。這些下游分析方法往往依賴高質量的RNA。可靠的RNA定量對于許多分子生物學應用至關重要。RNA定量的不準確，完整度低下，可能會對下游分析結果產生潛在的負面影響。早在1987年，科學家們已經充分認識到采用經過驗證的分析方法進行生物學研究的重要性[6]。然而，生物樣本研究相關的RNA分析的質控方法還沒有被完整的描述。一般而言，DNA質控項目由分析質控和功能質控組成，包括濃度、純度、完整度和聚合酶鏈反應成功率[7]，RNA質控可以一并借鑒。在本項工作中，根據ISO/IEC 17025∶2005中5.9的要求，選擇分光光度法對RNA質量濃度進行測定，用微流控芯片的方法對RNA完整度進行評價。本項工作對上海生物樣本庫網絡的最佳實踐規范有一定的借鑒意義，也為潛在的質控項目的標準操作規程的制定提供基礎。

1 材料與方法

1.1 RNA標準物質 Ambion?RNA Control 250(商品編號：AM7155)，購自美國Life Technologies公司，批號：13030291，標準值：255 ng/μL，包裝：2×20 μL，儲存溫度：-20 ℃。

1.2 分光光度計 由ISBER和盧森堡國家樣本庫合作組織的全球能力比對項目中，對于RNA的質量濃度和純度的計量提供了多種可選的方法，由參與該項目的實驗室根據自己的實際情況自行選擇。本項工作中，選擇了分光光度法進行所有的RNA定量工作，以NanoDrop 2000分光光度儀為分析平臺。

1.3 微流控芯片法 RNA的完整度評價采用RNA完整度(RNA integrity number，RIN)值系統，設備平臺為Aglient 2100。

1.4 方法驗證 為了檢驗分光光度法是否可以勝任其預期的目標,對其進行方法學驗證。方法學驗證方案的制訂，參考了美國食品和藥品管理局、國際協調會議以及美國藥典提供的規范。雖然此類研究的執行有一個總體的框架，但是具體執行時又存在著案例差異性[8]。

1.4.1 RNA的定量 定量的方法學驗證方案包括精密度、準確度和線性3個指標。

1.4.1.1 精密度 精密度的評估往往通過批內和批間的差異測試來實現。批內測試一直被認為是在最優條件下精密度測量。然而，批間測試或許是精密度的更優表現形式[9]，由于RNA的易降解性，不適合進行批間實驗。RNA定量的方法學驗證方案：選用Ambion?RNA Control 250為目標檢測物，在低質量濃度和高質量濃度分別進行重復檢測。NanoDrop 2000平臺選擇127.5 ng/μL 和25.5 ng/μL 2個質量濃度。由于精密度是圍繞一個中心值的變異概念，實際上直接測量得到的是不精密度。對于一個正態分布而言，不精密度往往由標準差(standard deviation，s)來表征[10]。

批內分析：在不同質量濃度水平，對RNA進行20次重復定量檢測。

測量值的數據分析按照如下公式進行:

(1)

(2)

變異系數(coefficientofvariation，CV)定義為：

(3)

本項工作中，CV≤10%認為是可以接受的[11]。

批內不精密度計算按照如下公式進行：

(4)

(5)

計算公式：

(6)

(7)

1.4.2 數據的可接受性 所有數據均經過Levey-Jennings質控法的檢驗[13]。

由于NanoDrop2000測定RNA和DNA的質量濃度時，共享同一個光密度(opticaldensity，OD)260，室內質控沿用DNA室內質控方法[14]。

1.4.3RNA完整度評價RNA完整度評價在Agilent2100上進行，指標采用RIN值評價系統。選擇的檢測對象為提取自人Hela細胞的總RNA。細胞數量為1×107，提取方法為傳統的TRIzol方法。得到的總RNA，分高低2個質量濃度，分別重復測定12次RIN值，求s及CV[參考公式(1)～(5)]，進行RIN值精密度評價。由于無法獲取人總RNA的標準物質，RIN值準確度無法進行評價。

考慮到試劑成本，RNA室內質控參考DNA室內質控數據，DNA定量需要每月進行室內控制[14]。

2 結果

基于NanoDrop 2000分光光度儀平臺，制備了2種質量濃度的標準物質作為分析對象，用于精密度和準確度分析的原始數據見表1。

表1 2種不同質量濃度水平的批內不精密度分析(ng/μL)

表2 2種質量濃度水平下的不精密度CVw

表3 2種質量濃度水平下的準確度

線性分析的數據見表4。CVw值大于10%的數據舍棄不用。線性回歸相關系數r2為0.999 6(圖1)，符合線性要求。

表4 線性分析數據

圖1 NanoDrop 2000平臺上的線性分析

利用人Hela細胞獲得的總RNA質量濃度為399 ng/μL，稀釋后得到109 ng/μL的低質量濃度RNA樣本。對2種樣本進行RIN值測定，分別重復12次，結果見表5、6，2種質量濃度水平下CVw小于10%。

表5 2種質量濃度水平下的RIN值

表6 2種質量濃度水平下RIN值的不精密度CVw

3 討論

生物樣本庫的行業目標是分析生物樣本，并將信息轉化為有序的數據，以服務于轉化醫學。上海醫藥臨床研究中心已經成為上海生物樣本庫網絡的中樞。中心為了保證生物樣本及其信息的高質量，引入了基于ISO/IEC17025∶2005的質量管理體系。按照質量保證和質量控制的原則，中心啟動了質量控制項目，并開發了一整套生物樣本存儲和處理的標準操作規程。

根據美國病理學家協會發布的《生物樣本庫認證項目檢視清單》和ISBER頒布的《2012生物樣本庫最佳實踐規范》，在樣本的收集、儲存、檢索、出庫、檢測及銷毀過程中存在很多質控點，這些樣本的質量評估依賴于各種技術分析之后獲得的樣本數據[15-16]。然而，這些方法的方法學驗證工作仍然是一片空白。

方法學驗證目的是為了證明分析方法的可接受性。近幾年，為醫藥工業提供數據信息的生物分析方法快速發展。總的來說，方法學驗證可以涵蓋特異性、準確度、線性、偏差、精密度、檢測限、定量限和魯棒性[8]。但是，這樣的理念在生物樣本庫領域并未被廣泛接受。

后基因組時代，人們對RNA的研究得到廣泛開展。根據業內廣泛達成的共識，本項工作對用于RNA定量的分光光度法進行了簡單的方法學驗證，包括精密度、準確度和線性。數據顯示，3個參數均符合臨界值的要求。該結果暗示了分光光度法完全可以勝任RNA定量檢測。為了監控檢測的有效性，并保證結果數據趨勢的可監測性，按照Westgard多規則，使用有證標準物質進行室內質控。RIN值評價系統的精密度分析也得到了通過。

這個簡單的RNA定量和完整度的驗證模型已經成為上海生物樣本庫網絡抽樣質控項目的組成部分。目前，參與該抽樣質控項目的醫院已經達到12家。

本項工作完全按照業內公認的原則進行，并嘗試將方法學驗證的概念引入生物樣本庫領域。作者認為本項工作仍然存在很多不足，如方法學驗證的內容比較簡單，僅選擇了3個參數進行驗證。換個角度考慮，檢測本身并不是關鍵，它可以很容易的被重復。但是，檢測是生物樣本價值的唯一釋放途徑，生物樣本最終的歸宿是轉化為數據。考慮到數據收集及挖掘將會是未來生物樣本庫的高級存在形式，在生物樣本庫運營之初，建議所有分析方法經過驗證后方可使用，以獲得高質量的數據，為后續的數據挖掘打下堅實的基礎。

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Method validation for RNA quality control in biobanking

RUANLiangliang1,ZHENGPeiyong2,YANGJiahong2,FANJinli1,GANRongxing1

(1.Shanghai Clinical Research Center, Shanghai 200233, China;2.Shanghai Hospital Development Center, Shanghai 200041, China)

Objective To perform method validation for RNA quality control. Methods There are three quality controls that are performed on isolated RNA: concentration, purity and integrity. The optical density (OD) at 260 nm is used to determine the RNA concentration in a solution. The ratio of the absorbance at 260 nm to 280 nm is used to assess the RNA purity of an RNA preparation. The integrity assessment is based on the RNA integrity number (RIN) system. In this work, we focused on the RNA concentration and integrity. According to the requirement of ISO/IEC 17025∶2005, the key factors of precision, accuracy and linearity testing were presented in assessing the method of RNA quantity. Precision testing on RNA integrity was also preformed. Results In this study, we focused on the validation of RNA quantitation by spectrophotometry, and performed precision, accuracy and linearity assessment. Total RNA from Hela cells was used for precision testing on RNA integrity. All the data were acceptable. Conclusion The method of spectrophotometry and RIN system are qualified for RNA quality control.

Quality management system; Method validation; Precision; Accuracy; Linearity

上海市科委研發項目資助(12DZ2294903，10DZ2251800)

200233 上海，上海醫藥臨床研究中心(阮亮亮，范錦立，甘榮興)；200041 上海，上海申康醫院發展中心(鄭培永，楊佳泓)

鄭培永，E-mail：zpychina@sina.com

R-05

A

2095-3097(2015)03-0161-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2015.03.009

2015-02-18 本文編輯：徐海琴)