大鼠原位氣管移植模型的建立

段鴻濤，黃 勛，劉宏剛，閆小龍，李小飛

大鼠原位氣管移植模型的建立

段鴻濤，黃 勛，劉宏剛，閆小龍，李小飛

目的建立同種異體大鼠原位氣管移植模型，為研究者提供可參考的建立模型的步驟。方法將10只SD大鼠氣管作為供體，質(zhì)量匹配后原位移植入20只SD大鼠體內(nèi)。于移植后第10天取移植氣管樣本做蘇木素和伊紅染色及馬松染色，觀察上皮覆蓋、纖維化程度。結果大鼠氣管移植模型手術存活19例，從樣本采集到手術成功用時(65±15) min。10 d后取材，蘇木素和伊紅染色可見上皮覆蓋雜亂，但上皮覆蓋完整；馬松染色可見上皮下纖維沉積。結論新建的大鼠氣管移植模型可以用于氣管移植相關領域的研究，可避免操作繁復、不能模擬呼吸運動引起的氣管活動及氣流的影響，避免異位移植容易出現(xiàn)的移植氣管機化。

氣管移植；動物模型；大鼠

通用的大鼠氣管移植模型可以分為氣管原位移植模型和異位移植模型[1]。異位移植模型術式主要為將氣管埋藏于大鼠腹腔大網(wǎng)膜以及大鼠背部皮下[2]。研究表明，原位移植和異位移植產(chǎn)生不同的病理結果，異位移植模型病理變化可作為閉塞性細支氣管炎研究的動物模型[3]。但異位移植模型不能模擬呼吸運動引起的氣管活動及氣流的影響，同時異位移植容易出現(xiàn)移植氣管機化，對于實驗研究有諸多限制[4]。原位移植因為技術問題，顯微外科器械的限制等原因，國內(nèi)開展相關研究較少。本實驗目的是為我國研究者提供一種可以在非顯微外科器械條件下進行的大鼠氣管原位移植手術方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SD大鼠30只，8周齡，購自第四軍醫(yī)大學動物實驗中心[SCXK-(軍)2007-007]，隨機挑取10只作為供體，另20只作為受體。

1.2 實驗設備和材料 眼科剪、眼科直鑷、眼科彎鑷、眼科持針器、6-0和5-0的帶線手術縫合針(山東藍礬新材料有限公司)，5-0和3-0的手術縫線(山東藍礬新材料有限公司)。地塞米松磷酸鈉注射液(阿斯利康制藥有限公司)、鹽酸東莨菪堿注射液(阿斯利康制藥有限公司)、青霉素鈉注射液(阿斯利康制藥有限公司)，胎牛血清(fetal borine serum，F(xiàn)BS，美國Hyclone公司)，達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modification Eagle′s medium，DMEM，美國Hyclone公司)。

1.3 獲取供體氣管 SD大鼠用0.3%戊巴比妥鈉2 mL/kg腹腔注射麻醉。在甲狀骨上方到縱隔入口處做頸正中切口，切口延至胸骨柄和胸骨，進而完成胸骨切開術。分離氣管周圍組織，取下完整供體氣管，用生理鹽水沖洗后，暫存于10% FBS的DMEM中。供體氣管切制成長度為5～6軟骨環(huán)，每一部分移植入一受體大鼠。

1.4 同種原位氣管移植動物模型 ①將SD大鼠用0.3%戊巴比妥鈉2 mL/kg腹腔注射麻醉，并給予地塞米松磷酸鈉注射液、鹽酸東莨菪堿注射液腹腔注射。②在甲狀軟骨上方約0.5 cm處做頸前正中切口(圖1A)。③解剖頸前筋膜，保護頜下腺，暴露胸骨舌骨肌(圖1B)。④正中鈍性分離胸骨舌骨肌，并用3-0的縫線將胸骨舌骨肌固定于頸前筋膜(圖1C)；將胸骨乳突肌正中向下和氣管軟骨環(huán)用5-0的縫線縫合，用以固定氣管，防止氣管離斷后氣管攣縮引起大鼠窒息(圖1D)。⑤分離氣管包膜，暴露氣管，保護氣管食管溝的動脈血管。在氣管甲狀軟骨以下3～4個環(huán)處離斷氣管，確保離斷切口平整(圖1E)。⑥取供體氣管，縫合遠端。在氣管“U”型環(huán)肌膜部5點方向用6-0縫線做斷端縫合，打結以確保兩斷端氣管緊貼為宜。同樣方法縫合7點，然后依次從氣管3點、12點、9點各縫合1針(圖1F)。⑦近端氣管縫合。在氣管5點、7點做間斷縫合，逆行性插入小鼠12號灌胃針做引導針(圖1G)，從口腔放入氣管插管，注意保護氣管，防止機械損傷(圖1H)。依次從氣管3點、12點、9點各縫合1針(圖1I)。⑧間斷縫合胸骨舌骨肌(圖1J)。⑨間斷縫合頸前筋膜(圖1K)。⑩間斷縫合皮膚，75%乙醇消毒(圖1L)。術后2 h，大鼠清醒前保持頭低腳高位，清醒后，拔出氣管插管。術后3 d青霉素鈉注射液30×104U/kg腹腔注射[5]。

圖1手術操作

1.5 評價方法 蘇木素和伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色及馬松染色評價上皮生長、纖維化程度。

2 結果

2.1 生存率 受體大鼠手術后存活率為95%，模型從樣本采集到手術成功用時(65±15) min；1只大鼠術中因窒息死亡，氣管內(nèi)和口鼻中可見大量的粉紅色泡沫痰。大鼠1只于術后9 d死于氣管內(nèi)大量的膿性分泌物，同時肺部有大量肺膿腫；另1只于術后10 d死于大量的呼吸道黏液性分泌物。移植模型中，大鼠最長存活時間為6個月，生命體征平穩(wěn)，但有輕度的吸氣性呼吸困難。

2.2 HE染色 術后10 d，與正常大鼠氣管相比(圖2A)，氣管移植體可見大量炎性細胞浸潤(圖2B)；上皮覆蓋雜亂，但上皮覆蓋完整；氣管纖毛明顯脫落，上皮層變薄，黏膜固有層變厚(圖2C)；同時可見團塊狀纖毛形成，上皮發(fā)生聚集現(xiàn)象，氣管上皮層雜亂(圖2B)。術后90 d，可見氣管黏膜上皮脫落，甚至消失，大量纖維沉積，氣管管腔發(fā)生嚴重堵塞(圖2D)。

2.3 馬松染色 術后10 d，與正常大鼠氣管相比(圖2E)移植段氣管纖維沉積，黏膜固有層明顯變厚(圖2F)。

A:正常上皮氣管HE染色B:術后10d氣管HE染色(1)C:術后10d氣管HE染色(2)D:術后90d氣管HE染色E:正常氣管上皮馬松染色F:術后10d氣管馬松染色圖2 氣管HE染色和馬松染色

圖2 氣管HE染色和馬松染色

3 討論

本實驗成功實施了20只大鼠原位氣管移植手術，術后總體存活率為95%。移植后大鼠最長存活時間為6個月。與異位氣管移植模型相比，原位氣管移植避免了異位氣管移植不能通氣、沒有活動度不能完全模擬氣管呼吸運動與環(huán)境的缺點[6]。

在建模過程中，首先建立的是同系移植模型(SD-SD大鼠)，避免了免疫排斥反應；之后，又采用胸骨舌骨肌間斷縫合包繞氣管的方法，可以使得胸骨舌骨肌間接給予氣管血供，這樣很好地解決了氣管移植后血供不足的問題[7]。

在本實驗過程中，19只大鼠術后生命體征平穩(wěn)，生存狀態(tài)良好，僅有2只在術后死亡。1只于移植術后9 d死于氣管膿腫及肺膿腫，可能是因為在移植后，破壞了氣管內(nèi)正常的解剖結構，破壞了氣管內(nèi)黏膜上皮，使其失去了黏膜屏障保護功能；同時，氣管黏膜損傷后，黏液性分泌物增多[8]，增加了呼吸道微生物滋生的可能性，最后形成氣管膿腫及肺膿腫。另1只于移植術后10 d死于氣管內(nèi)黏液性分泌物，分泌物的來源可能是來自頭頸部的大腺體，也可能因為呼吸道的正常結構破壞后，增加了呼吸道黏膜的分泌功能[9]。在實驗中觀察到，當受體大鼠出現(xiàn)明顯的吸氣性呼吸困難時，給予鹽酸氨溴索注射液后，大鼠相應的癥狀就有明顯的減輕，由此推測分泌物來自于呼吸道分泌物增多的可能性大。另外，因為手術，大鼠咳嗽反射抑制，無法正常將分泌物咳出，最終形成窒息。HE染色示大鼠氣管黏膜上皮雜亂，在術后10 d HE染色可見團塊狀纖毛形成，可能是因為大鼠上皮在移植后再生形成不規(guī)則結構[10]，術后10 d大鼠氣管黏膜固有層變厚。術后90 d可見大鼠氣管管腔大量纖維沉積，氣管管腔堵塞。術后10 d，馬松染色也顯示氣管黏膜下纖維沉積，證實大鼠發(fā)生了呼吸道梗阻。在組織染色中，沒有見到氣管外周以及周圍組織出現(xiàn)機化現(xiàn)象。

通過本實驗研究，建立了一種良好的用于氣管原位移植的大鼠模型，它可以完全模擬氣管呼吸引起的作用，在研究氣管原位移植后的相關病理機制中將會發(fā)揮重要作用。

[1]趙晉波,李小飛，劉錕，等.同種異體近交系小鼠原位氣管移植模型的建立[J].第四軍醫(yī)大學學報,2007，28(6):540-543.

[2]Fernández FG,McKane B,Marshbank S,et al.Inhibition of obliterative airway disease development following heterotopic murine tracheal transplantation by costimulatory mole-cule blockade using anti-CD40 ligand alone or in combination with donor bone marrow[J].J Heart Lung Transplant,2005,24(7 Suppl):S232-S238.

[3]何建行,梁兆煜，楊運有，等.同種異體氣管移植一例[J].中華外科雜志,2000，38(8):595-597.

[4]Zhao Y,Steidle JF,Upchurch GR,et al.Prevention of the second stage of epithelial loss is a potential novel treatment for bronchiolitis obliterans[J].J Thorac Cardiovasc Surg，2013，145(4):940-947.

[5]Schrepfer S,Deuse T,Hoyt G,et al.Experimental orthotopic tracheal transplantation: the Stanford technique[J].Microsurgery，2007，27(3):187-189.

[6]Fan K,Qiao XW,Nie J,et al.Orthotopic and heterotopic tracheal transplantation model in studying obliterative bronchiolitis[J].Transpl Immunol,2013,28(4):170-175.

[7]Hysi I,Kipnis E,Fayoux P,et al.Successful orthotopic transplantation of short tracheal segments without immunosuppressive therapy[J].Eur J Cardiothorac Surg,2015,47(2):e54-e61.

[8]Kuo E,Bharat A,Shih J,et al.Role of airway epithelial injury in murine orthotopic tracheal allograft rejection[J].Ann Thorac Surg,2006,82(4):1226-1233.

[9]Okazaki M,Gelman AE,Tietjens JR,et al.Maintenance of airway epithelium in acutely rejected orthotopic vascularized mouse lung transplants[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2007,37(6):625-630.

[10]Gillen JR,Zhao Y,Harris DA,et al.Short-course rapamycin treatment preserves airway epithelium and protects against bronchiolitis obliterans[J].Ann Thorac Surg,2013,96(2):464-472.

Establishment of rat orthotopic tracheal transplant mode

DUANHongtao,HUANGXun,LIUHonggang,YANXiaolong,LIXiaofei

(Department of Thoracic Surgery, Tangdu Hospital, the Fourth Military Medical University,Xi’an Shanxi 710038, China)

Objective To establish the rat orthotopic tracheal transplant model. Methods After weight-matched,10 rats were choosen as donators, then we transplanted the tracheal to the receptors to establish orthotopic tracheal transplant model. Tracheal grafts were harvested after 10 days, histological examination using hematoxylin and eosin stain (HE) staining and masson′s staining to observe the epithelium and fibrin deposition. Results Nineteen rats were living until they were sacrificed. All surgerys were finished in (65±15) min from the collection of specimens. After ten days, the rats were killed, histological examination included HE staining and Masson′s staining. HE staining shown the epithelium were messy, but the epithelium completed; Masson′s staining showed fibers were subepithelial deposition. Conclusion The new model of rat tracheal grafts could be used to study of the tracheal transplantation. It could avoid the complicated operation and avoid to appear the organization in heterotopic transplantation. At the same time, it could simulate the effect of tracheal breathing motion and airflow.

Tracheal transplantation; Animal model; Rats

國家自然科學基金(81370115)

710038 陜西 西安，第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院胸外科(段鴻濤，黃 勛，劉宏剛，閆小龍，李小飛)

R655.3-332

A

2095-3097(2015)03-0137-04

10.3969/j.issn.2095-3097.2015.03.003

2015-03-21 本文編輯：徐海琴)