丙型肝炎病毒攜帶者病毒基因型分布特征及臨床意義

西安交通大學第二附屬醫院檢驗科(西安710004)

李步榮 張 彤 李麗華 高 寧 甄長安 張 毅 魏亞鳳 張西英

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丙型肝炎病毒攜帶者病毒基因型分布特征及臨床意義

西安交通大學第二附屬醫院檢驗科(西安710004)

李步榮 張 彤 李麗華 高 寧 甄長安 張 毅 魏亞鳳 張西英

目的：研究丙型肝炎病毒(HCV)攜帶者病毒基因型流行趨勢和分布特征，探討其臨床應用價值。 方法：隨機收集無臨床癥狀HCV攜帶者血清樣本共計90例,HCV RNA含量大于1×103IU/ml,其中男58例,女32例。應用聚合酶鏈式反應(PCR)和反向斑點雜交技術(RDB)進行HCV基因分型檢測,并對受檢者相關資料進行分析。結果：HCV攜帶者HCV RNA平均濃度為4.94±1.36 lg IU/ml。不同性別組之間HCV RNA含量無明顯差異(P>0.05)。所有標本HCV基因成功分型。單基因型感染為主要感染類型,占95.56%(86/90)。其中1b型感染率為48.89%(44/90)，2a型感染率為42.22(38/90)。不同性別組HCV攜帶者HCV基因型分布差異無統計學意義(P>0.05)。結論：本地區HCV攜帶者感染主要類型為單基因型感染；HCV 1b為主要基因型,其次為2a型；開展HCV基因型檢測具有重要的臨床意義。

丙型肝炎病毒(HCV)感染后只有少數感染者可以憑借自身免疫力達到自愈，絕大多數感染者表現為持續感染。據世界衛生組織統計,全球有上億人感染HCV,我國有將近4000萬人感染HCV,并且有逐年遞增的趨勢[1]。其中一部分患者長期無明顯臨床癥狀，沒有引起患者足夠的重視,未進行積極臨床治療,導致疾病持續發展,錯失治療的最佳時機。目前公認比較有效的治療藥物為干擾素,但病毒不同基因型對藥物的應答不同[2]。HCV基因型分布具有明顯的地域和人群分布差異性,不同基因型引起的臨床表現也不盡相同[3]。對于無明顯臨床癥狀的攜帶者開展病毒基因型檢測更能真實反映本地區HCV流行趨勢和病毒基因型分布特征。本研究應用PCR-RDB雜交法檢測西安地區HCV攜帶者血清HCV基因型分布特征,現將結果報道如下。

對象與方法

1 對 象 隨機收集2013年7月至2014年12月就診于我院,丙肝抗體檢測陽性,HCV RNA定量檢測結果高于1×103IU/ml,無明顯臨床癥狀HCV病毒攜帶者血清樣本共90份,其中男58例,年齡7～75歲,平均40.72±15.45歲；女32例,年齡12～67歲，平均36.84±17.86歲。所有患者診斷符合《中國丙型肝炎防治指南》制定的標準,并排除丙型肝炎以外的其它類型肝炎病毒感染[4]。所有患者均為早晨空腹靜脈采血10ml,室溫靜置2h,4000 rpm離心5min分離血清,立即檢測或保存于-20 ℃冰箱備用。

2 主要試劑和儀器 丙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒(湖南圣湘生物科技有限公司)；丙型肝炎病毒基因分型試劑盒(中山大學達安基因股份有限公司)；ABI 7500型實時定量熒光PCR擴增儀(美國ABI應用生物系統公司)；TC-412型TECHNE通用PCR 儀 (英國Bibby Scientific Limited公司)；YN-H16型分子雜交儀 (深圳亞能生物技術有限公司)；TGL-16g高速低溫離心機 (上海安亭科學儀器廠)；THZ-82恒溫振蕩器(常州國華電器有限公司)。

3 RT-PCR定量檢測HCV RNA 嚴格按照湖南圣湘生物科技有限公司生產的HCV病毒核酸定量檢測試劑說明書進行實驗操作，設置相關儀器參數，檢測HCV病毒濃度。該試劑最低檢出值為25 IU/ml，線性范圍 50～5×108IU/ml。對于測定值大于1×108IU/ml的樣本，擴增曲線為明顯的S型，應進行樣本稀釋后再定量檢測。

4 PCR-RDB分子雜交進行HCV基因分型 RNA的提取:取滅菌1.5 ml離心管,加入50 μl RNA蛋白酶K，同時加入200 μl血清,再加入200 μl病毒裂解液，振蕩混勻，高速離心10s,72℃放置10 min。小心加入250 μl無水乙醇,振蕩混勻。將混合液轉入離心柱,12000 rpm離心1 min,棄去離心液。離心柱中加入500μl抑制物去除液,12000rpm離心1 min。離心柱中再加入500 μl去離子液,12000 rpm 離心1 min,重復1次。將離心柱移入新的收集管,14000 r/min 離心3 min去除殘余的乙醇。將離心柱移入新的無菌離心管中，72 ℃放置2 min。加入預熱的洗脫液50μl,室溫靜置1 min,14000 rpm離心1 min。RT-PCR擴增：在反應管中加入30 μl提取的病毒核酸,按下列條件進行擴增：50℃逆轉錄25 min,95℃ 15 min預變性(94℃ 30s,55℃ 40s,72℃ 45s)×45 cycles,72℃延伸7 min。分子雜交：每個5 ml離心管中加入4±0.5 ml預熱的雜交液Ⅰ,放入標記好的雜交膜條,將經98 ℃變性10 min的擴增產物加入雜交液中,50 ℃雜交60 min。顯色和判讀結果：取50ml滅菌離心管,加入25 ml預熱的雜交液Ⅱ和30 μl溶液Ⅰ,移入膜條,50 ℃振蕩10 min。棄去雜交液Ⅱ,加入新的雜交液Ⅱ,室溫條件下振蕩10 min。新鮮配制顯色液,移入膜條,避光反應5～10 min。將膜條移入去離子水中浸泡1～3 min,可肉眼直接判讀結果,必要時借助閱讀儀掃描判讀結果。

結 果

1 不同性別組HCV RNA定量檢測結果 見表1。不同性別組HCV RNA定量檢測結果取常用對數整理成表1。男性患者占64.44%,HCV RNA平均濃度為4.89±1.41 lg IU/ml,女性患者占35.56%，HCV RNA平均濃度為5.02±1.26 lg IU/ml,全部樣本HCV RNA平均濃度是4.94±1.36 lg IU/ml。經統計學處理不同性別組HCV RNA含量差異無統計學意義。

表1 不同性別組HCV RNA含量

2 HCV基因型檢測結果 見表2。1b型和2a型為主要單基因感染型，分別為48.89%(44/90)和42.22%(38/90),其它基因型少見。單基因型感染是主要感染類型95.56%(86/90),1b和2a型混合感染型4.44%(4/90)。

表2 HCV基因型檢測結果

3 不同性別組基因分布結果 見表3。不同性別HCV攜帶者HCV基因型分布差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 不同性別組HCV基因型分布

討 論

HCV主要通過血液傳播途徑,常引起的急、慢性肝炎,臨床上存在一部分HCV感染患者,由于機體的自身免疫系統的免疫清除作用,將病毒的繁殖破壞活動控制在一定的水平,無明顯的臨床表現,肝功能檢查正常,稱為HCV攜帶者。這部分患者血清HCV RNA檢測呈現陽性,本研究受試者血清HCV RNA平均濃度為4.94±1.36 lg IU/ml,說明病毒在機體體內活動活躍,只是由于機體的免疫應答作用,患者并無臨床表現,但是該類患者具有傳染性,對這部分患者要及早發現,提高自身認知疾病的能力,及早進行積極抗病毒治療。本研究結果顯示不同性別組HCV RNA含量無明顯差異。目前尚無有效的丙肝疫苗預防 HCV 感染及特效的治療藥物。臨床公認比較有效的藥物是干擾素,有研究報道不同基因型對干擾素的應答表現不盡相同,有必要在進行抗病毒治療前進行基因型檢測，對臨床醫生制定科學合理的治療方案有一定的參考價值[5]。

HCV 病毒呈球形,直徑80 nm,為單股正鏈RNA病毒,長約9.5kb,主要由兩端非編碼區(NCR)和一個大的開放讀碼框(ORF)組成。RNA聚合酶自身缺乏校正功能,導致HCV RNA容易發生突變,HCV RNA呈高度異質性。HCV基因型與亞型在世界范圍內存在流行分布差異。高可變區的異質性有利于病毒逃避機體的免疫清除。HCV基因組各部位的變異頻度不盡相同,core 蛋白編碼區較為保守、NS區次之,E1/E2/NS5為高可變區,常用作 HCV 的基因分型和進化分析的靶序列。不同基因型的序列差異達 30% 以上,不同亞型差異度在 15%～30%之間。我國大部分地區流行的HCV基因亞型為1b型,其次為2a型[6]。HCV基因型決定病毒某些生物學特性,一定程度決定了病毒致病力的大小,與患者臨床治療效果、對干擾素應答的敏感性以及判斷疾病預后密切相關本次研究結果表明,本地區HCV病毒攜帶者基因型分布存在多樣性,1b型和2a型為主要基因型,分別為48.89%(44/90)和42.22%(38/90),其它基因型少見。單基因型感染是主要感染類型95.56%(86/90),1b和2a型混合感染型4.44%(4/90),未見其它類型混合感染。此結果與已有報道基本相似,但也存在一定差異。統計學分析,不同性別組HCV基因型分布差異無統計學意義。表明不同性別HCV攜帶者在抵抗不同基因型HCV病毒感染免疫應答上無明顯差別。

我國幅員遼闊,人口眾多,人員流動頻繁,HCV 總體感染率較高,各地區的HCV基因型分布呈現動態變化的狀態,無癥狀HCV病毒攜帶者進行基因型檢測更能有效反映本地區的基因型分布狀態,應用PCR-RDB雜交技術積極開展HCV基因型檢測,有利于掌握HCV病毒的種系發育和進化特性,不斷完善HCV基因型流行病學相關資料，為 HCV 疫苗的設計研發和臨床制定合理的個體化治療方案和判斷預后提供科學的實驗室依據。

[1] Aman W,Mousa S,Shiha G,etal.Current status and future directions in the management of chronic hepatitis C[J].Virol J,2012,9(3)：57-67.

[2] Clausen LN,Weis N,Ladelund S,etal. Genetic variants in the apoptosis gene BCL2L1 improve response to interferon-based treatment of hepatitis C virus genotype 3 infection[J].Int J Mol Sci,2015, 16(2)：3213-3225.

[3] 陳 顯,黃成垠,朱紹汶,等.丙型病毒性肝炎的基因分型方法及臨床意義[J].臨床輸血與檢驗,2012, 14(1)：89-92.

[4] 中華醫學會肝病學分會,中華醫學會傳染病與寄生蟲病學分會.丙型肝炎防治指南[J].中華肝臟病雜志,2004,12(4)：194-198.

[5] Nguyen NH,McCormack SA,Vutien P,etal.Meta-analysis：superior treatment response in Asian patients with hepatitis C virus genotype 6 versus genotype 1 with pegylated interferon and ribavirin[J].Intervirology,2015,58(1)：27-34.

[6] 蘇迎盈，劉慧鑫，汪 寧.中國丙型肝炎病毒基因型分布[J].中華流行病學雜志， 2013,34(1)：80-84.

(收稿：2015-02-02)

Clinical significance and distribution characteristics of hepatitis C virus genotypes in hepatitis C virus carriers

Department of Clinical Laboratory, Second Affiliated Hospital, Xi’an Jiaotong University( Xi’an 710004)

Li Burong Zhang Tong Li Lihua et al

Objective：To study the prevalence and distribution characteristics of hepatitis C virus (HCV) genotypes and to explore the clinic significance of HCV genotypes in HCV carriers. Methods：We conducted a cohort study with 90 participants including 58 male patients and 32 female patients. The HCV RNA levels of all sera samples were confirmed higher than 1×103IU/ml.HCV genotyping was performed using type-specific primers by means of polymerase chain reaction(PCR) and reverse dot blot(RDB). The related data of all subjects were analyzed. GraphPad Prism 5.0 software was used for statistical analysis. Results：The average concentration of HCV RNA in sera was 4.94±1.36 log IU/ml. All 90 specimens were genotyped successfully.There were no significant difference between the different gender groups about the HCV RNA levels of all sera(P>0.05).HCV 1b was the most predominant genotype 48.89%(44/90),followed by HCV 2a 42.22%(38/90).The single HCV genotype infection was frequently detected among all patients. Its infection ratio was 95.56%(86/90).There was no significant difference between the different gender groups about the distribution of HCV genotypes(P>0.05).Conclusion：The single HCV genotype infection is primary infection style.HCV 1b is the most frequently detected genotype in patients infected with HCV,following by HCV 2a.It is significant for clinical treatment to detect the genotypes of HCV.

Hepatitis C virus Genotype Polymerase chain reaction Reverse dot blot

丙型肝炎病毒 基因型 聚合酶鏈式反應 反向斑點雜交

R521.63

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.10.046