鮑曼不動桿菌生物膜形成能力與耐藥性相關性研究

西安市中心醫院呼吸內科(西安710003)

黃妙毅 劉 安

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鮑曼不動桿菌生物膜形成能力與耐藥性相關性研究

西安市中心醫院呼吸內科(西安710003)

黃妙毅 劉 安

目的：探討鮑曼不動桿菌生物膜形成能力與其耐藥性的相關性。方法：對分離得到的鮑曼不動桿菌160株,采用黏附半定量法測量生物膜形成能力,比較不同生物膜形成能力的鮑曼不動桿菌對美羅培南、亞胺培南、頭孢哌酮-舒巴坦、阿米卡星、左氧氟沙星、頭孢吡肟、頭孢他啶、氨曲南及哌拉西啉他唑巴坦9種抗菌藥物的耐藥性影響。結果：160株鮑曼不動桿菌中96株為多重耐藥菌(60%),59株為泛耐藥菌(36.89%)。149株具有生物膜形成能力(93.13%),其中弱陽性36株,陽性52株,強陽性61株。隨著生物膜形成能力的增強(弱陽性、陽性、強陽性),鮑曼不動桿菌對亞胺培南(50%、75%、81.96%)、左氧氟沙星(44.44%、53.85%、70.49%)、氨曲南(63.89%、88.46%、90.16%)的耐藥率顯著增強。結論：鮑曼不動桿菌生物膜形成能力較強，隨著生物膜形成能力的增強,其對亞胺培南、左氧氟沙星及氨曲南耐藥性增強。

鮑曼不動桿菌是一種非發酵的革蘭陰性桿菌,它廣泛分布于自然界和醫院環境中，是導致醫院感染最常見的條件致病菌之一,可引起呼吸機相關性肺炎、導管相關性血流感染、腦膜炎、泌尿系感染及傷口感染等,近年來它已經成為醫院感染的主要致病菌,且耐藥情況嚴峻[1]。越來越多的研究發現,鮑曼不動桿菌的耐藥性與其細菌的生物膜有著密切的關系[2]。本研究對我院臨床分離的160株鮑曼不動桿菌生物膜形成情況以及生物膜形成能力與耐藥性的關系進行探討,現報道如下。

材料與方法

1 菌株來源 2014年1～12月我院住院患者標本中分離的鮑曼不動桿菌,剔除同一患者中同一部位分離的重復菌株,共160株,其中痰液110株,支氣管分泌物26株,傷口分泌物12株,引流液5株,尿液3株,血液2株,腦脊液2株。

2 藥敏試驗 采用VITEK2系統對病原菌進行分析鑒定及最低抑菌濃度(MIC)測定,采用紙片擴散法(K-B法)測定抑菌圈直徑,根據美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)2012年標準判定細菌耐藥性,銅綠假單胞菌ATCC27853為質控菌株。測試抗菌藥物為美羅培南、亞胺培南、頭孢哌酮舒巴坦、阿米卡星、左氧氟沙星、頭孢吡肟、頭孢他啶、氨曲南及哌拉西啉他唑巴坦9種。

3 生物膜的培養及測定[3-4]將菌株劃線培養于麥康凱培養基上,37℃過夜振蕩培養,第2日挑取單菌落放至含4 ml溶菌肉湯(LB)液體培養基的試管中,置于恒溫震蕩器37℃振蕩培養18 h,用新鮮LB液體培養基將菌液配制成1.5×108cfu/ml的菌懸液,將菌懸液接種于96孔聚苯乙烯板上,每孔加入菌液200μl,設4個復孔,靜置于25℃細菌培養箱中培養48 h,吸出上清液,用PBS清洗2次去除浮游菌,固定液固定,PBS清洗,加入0.1%結晶紫染料,染色15 min,吸出染液,PBS清洗,每孔加入95%乙醇200μl,溶解結晶紫,用酶標儀檢測各孔在波長570 nm處的吸光度(A)值,未加菌液的空白培養基均值為Ac。將菌株生物膜的形成能力分為4類：A≤Ac為陰性(-)；Ac4Ac為強陽性()。

4 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件分析數據,計數資料采用χ2檢驗,P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 鮑曼不動桿菌耐藥情況測定 見表1。160株鮑曼不動桿菌中96株為多重耐藥菌(60%),59株為泛耐藥菌(36.89%)。

表1 160株鮑曼不動桿菌對9種抗菌藥物耐藥性 (%)

2 生物膜形成能力與耐藥性分析 見表2。149株具有生物膜形成能力(93.13%),其中弱陽性36株,陽性52株,強陽性61株。鮑曼不動桿菌對亞胺培南、頭孢哌酮-舒巴坦、阿米卡星、左氧氟沙星及氨曲南的耐藥性在不同生物膜強度組差異有統計學意義 (均P<0.05)。隨著生物膜形成能力的增強,對亞胺培南、左氧氟沙星、氨曲南的耐藥率顯著增強,其他藥物則無相關性。

表2 鮑曼不動桿菌生物膜形成能力與其耐藥性 [株(%)]

討 論

鮑曼不動桿菌已經成為近年引起醫院獲得性感染的主要病原菌之一，隨著廣譜抗菌藥物的廣泛應用，多重耐藥及泛耐藥鮑曼不動桿菌逐年增多,增加了臨床治療難度,鮑曼不動桿菌感染后病死率逐年上升,本研究收集的160株鮑曼不動桿菌中96株為多重耐藥菌(60%),59株為泛耐藥菌(36.89%),除頭孢哌酮舒巴坦耐藥率較低，其他藥物耐藥率均在50%以上,耐藥情況嚴峻。

近年來,國內外學者研究發現,生物膜與鮑曼不動桿菌的耐藥性密切相關，細菌生物膜是指細菌在不利于其生長的環境下，通過自身產生的胞外多糖被膜多聚物相互粘連形成的細菌群落,本實驗采用96孔板上培養48 h后測定生物膜形成能力,發現93.13%的鮑曼不動桿菌菌株能形成生物膜,有較強的生物膜形成能力。目前關于鮑曼不動桿菌生物膜形成能力與耐藥性的關系尚存在爭議,Rao等[5]研究顯示生物膜形成陽性菌株較陰性菌株對頭孢噻肟、環丙沙星及氨曲南的耐藥性增強；而Espinal等[6]研究發現生物膜形成能力與耐藥性呈負相關。本研究發現鮑曼不動桿菌對亞胺培南、頭孢哌酮-舒巴坦、阿米卡星、左氧氟沙星及氨曲南的耐藥性在不同生物膜強度組有顯著性差異。隨著生物膜形成能力的增強，對亞胺培南、左氧氟沙星、氨曲南的耐藥率顯著增強，其他藥物則無相關性。研究表明生物膜胞外多糖阻礙抗菌藥物進入細菌內膜靶點,降低抗生素的作用[7],細菌生物膜內營養的缺乏使細菌生長與代謝較游離態緩慢,對常見抗生素不敏感[8]。生物膜內細菌的群體效應調節某些基因的表達而導致耐藥,如外排泵的表達增強,能主動將抗生素泵出細菌外。多種機制參與了生物膜的耐藥。

通過對我院分離得到的鮑曼不動桿菌的耐藥性研究,發現生物被膜與鮑曼不動桿菌耐藥性之間存在明顯的相關性,但細菌耐藥是多因素共同作用的結果，鮑曼不動桿菌生物膜內細菌有50%以上能表達與浮游細菌不同的特異性蛋白產物,產生生物膜獨特表型,有報道稱在生物膜的密閉系統中,生物信號誘導的基因表達水平可以提高20倍[9]。進一步在基因水平、蛋白水平探討耐藥性基因片段和生物膜形成的機制,才能更有效的治療鮑曼不動桿菌感染。

[1] 尹變玲,劉 赟,陳葆青.呼吸系統疾病436例病原菌分布及其耐藥性分析[J].陜西醫學雜志,2014,43(9)： 1127-1129.

[2] Gurung J,Khyriem AB,Banik A,etal.Association of biofilm production with multidrug resistance among clinical isolates of Acinetobacter baumanniiand Pseudomonas aeruginosa from intensive care unit[J].Indian J Crit Care Med,2013,17(4)：214-218.

[3] 王 政,劉 丁,黃冬梅,等.鮑曼不動桿菌臨床分離株生物被膜形成能力與耐藥性的研究[J].中國病原生物學雜志,2010,5(6)：405-407.

[4] Marti S,Rodrlguez-Bano J,Catel-Ferreira M,etal.Biofilmformation at the solid -liquid and air-liquid interfaces by Acinetobacter species[J].BMC Res Notes,2011,4：5.

[5] Rao RS,Karthika RU,Singh SP,etal.Correlation between biofilm production and multiple drug resistance in imipenem resistant clinical isolates of Acinetobacter baumannii[J].Indian J Med Microbiol,2010,26(4)：333-337.

[6] Espinal P,Marti S,Vila J.Effect of biofilm formation on the survival of Acinetobacter baumanniion dry surfaces[J].J Hosp Infect,2012,80(1)：56-60.

[7] 游 洋,顧偉杰,王 錚,等．鮑曼不動桿菌生物膜形成與耐藥的相關性初探[J]．中國病原生物學雜志，2012，7(7)：500.

[8] Barth VC Jr,Rodrigues BG,Bonatto GD,etal.Heterogeneous persister cells formation in Acinetobacter baumannii[J].Plos One,2013,8(12)：84361.

[9] Rumbo-Feal S,Mez MJ,Gayoso C,etal.Whole transcriptome analysis of Acinetobacter baumannii assessed by RNA-sequencing reveals different mRNA expression profiles in biofilm compared to planktonic cells[J].PLos One,2013,8(8)：72968.

(收稿：2015-03-10)

細菌 生物膜 抗藥性,多藥,細菌 @鮑曼不動桿菌

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10.3969/j.issn.1000-7377.2015.10.045