細(xì)胞外基質(zhì)硬度對(duì)成骨細(xì)胞MC3T3-E1形態(tài)、增殖及礦化能力的影響

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬紅會(huì)醫(yī)院(西安710054)

劉 蕾 談雯雯 楊團(tuán)民 張改琴 陳秀錦

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細(xì)胞外基質(zhì)硬度對(duì)成骨細(xì)胞MC3T3-E1形態(tài)、增殖及礦化能力的影響

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬紅會(huì)醫(yī)院(西安710054)

劉 蕾 談雯雯 楊團(tuán)民 張改琴 陳秀錦

目的：探討不同細(xì)胞外硬度凝膠基質(zhì)對(duì)成骨細(xì)胞MC3T3-E1形態(tài)、增殖以及礦化能力的影響。方法：通過調(diào)整丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺單體的相對(duì)濃度,制備出硬凝膠基質(zhì)(交聯(lián)度16%,楊氏模量為25 kPa)和軟凝膠基質(zhì)(交聯(lián)度5%,楊氏模量為5 kPa)。用不同硬度的細(xì)胞外凝膠基質(zhì)來培養(yǎng)成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞，分別采用免疫熒光、MTT比色以及茜素紅染色等方法研究不同硬度的凝膠基質(zhì)對(duì)細(xì)胞形態(tài)、增殖以及礦化等功能的影響。結(jié)果：MTT比色法檢測結(jié)果顯示聚丙烯酰胺凝膠浸提液對(duì)成骨細(xì)胞MC3T3-E1的活性均無影響，生物相容性好。MC3T3-E1細(xì)胞形態(tài)隨著細(xì)胞外凝膠基質(zhì)硬度的降低,其形狀由從梭形向長條形變化。細(xì)胞外硬凝膠基質(zhì)和軟凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞,鋪展面積具有顯著性差異(P<0.01)。隨著培養(yǎng)基質(zhì)硬度的降低,MC3T3-E1細(xì)胞的增殖受到抑制；在硬基質(zhì)表面培養(yǎng)的細(xì)胞,經(jīng)礦化誘導(dǎo)后染色,鈣結(jié)節(jié)明顯可見；在細(xì)胞外軟基質(zhì)表面培養(yǎng)的細(xì)胞，經(jīng)礦化誘導(dǎo)后染色,無明顯的鈣結(jié)節(jié)出現(xiàn) (P<0.01)。結(jié)論：細(xì)胞外軟凝膠基質(zhì)對(duì)成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1鋪展、增殖和礦化具有抑制作用,提示力學(xué)刺激減少不利于成骨細(xì)胞生長。

細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基底硬度的響應(yīng)實(shí)際上是對(duì)一種特殊力學(xué)刺激(牽張力)的響應(yīng)，這種響應(yīng)是把力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為生物信號(hào),即力-化學(xué)耦合實(shí)現(xiàn)的[1]。黏附型細(xì)胞自身和胞外基質(zhì),兩者共同建立了一個(gè)力學(xué)微環(huán)境。細(xì)胞外基質(zhì)硬度對(duì)細(xì)胞生物學(xué)的影響十分廣泛,細(xì)胞形態(tài)、運(yùn)動(dòng)、生長增殖和分化都受到細(xì)胞外基質(zhì)硬度的影響。因此，研究細(xì)胞外基質(zhì)硬度對(duì)細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的影響,對(duì)某些疾病的發(fā)生、產(chǎn)生的原因都有著積極的推動(dòng)作用。成骨細(xì)胞作為骨形成的主要細(xì)胞之一,對(duì)胞外力學(xué)環(huán)境的變化,尤其是對(duì)胞外基質(zhì)硬度變化較為敏感[2]。本研究建立了硬度可調(diào)、重復(fù)性好、可控性強(qiáng)的細(xì)胞外基質(zhì)凝膠,比較了成骨細(xì)胞在不同基質(zhì)硬度條件下,細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖和細(xì)胞礦化的情況,為進(jìn)一步闡明成骨細(xì)胞對(duì)機(jī)械刺激的響應(yīng)提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),并為骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制以及腫瘤骨轉(zhuǎn)移提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1 材 料 ①試劑：NaOH由鄭州派尼化學(xué)試劑廠提供；戊二醛由天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供；HEPES、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨由美國Amresco公司提供；TEMED由美國Bio-Rad公司提供；APTES由美國Sigma公司提供；I型膠原由美國BD Biosciences公司提供；Sulfo-SANPAH由美國Pierce公司提供；22mm×22mm 蓋玻片由江蘇飛舟玻塑有限公司提供；10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿由加拿大JET BIOFIL公司提供；MTT由寶信生物公司提供；75%酒精由山東瑞泰科技有限公司提供；α-MEM培養(yǎng)基由美國Gibco公司提供；胎牛血清由美國Hyclone公司提供；L-谷氨酰胺由華美生物工程公司提供；胰蛋白酶由華美生物工程公司提供；鏈霉素、青霉素、DMSO由美國Sigma公司提供。②儀器：電子pH計(jì)(PP-50)和電子天平(BS2202S)德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；超純水制備系統(tǒng)(Elix)美國Millipore; CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 (HERA cell 150)德國Heraus;多功能酶標(biāo)儀(SynergyTMHT)美國BIO-TEK;制冰機(jī)(SIM-F1)日本Sanyo;臥式恒溫培養(yǎng)搖床(ZHWY-100B)上海智誠;倒置顯微鏡(Eclipse TS100)日本Nikon公司; 超凈工作臺(tái)(SW-CJ-IF)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司; 臥式恒溫培養(yǎng)搖床(ZHWY-100B)上海智誠; 紫外消毒車(ZXC型)江陰市光電儀器有限公司; 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(TCP010006)加拿大JET BIOFIL公司; 低溫臺(tái)式高速離心機(jī)(Primo R)美國Thermo公司。

2 細(xì)胞外基質(zhì)凝膠制備及特性檢測 ①細(xì)胞外基質(zhì)凝膠制備：聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)的制備主要參照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行。用滴管在22 mm×22 mm的蓋玻片表面涂抹少量的0.1N NaOH溶液，室溫干燥；再在處理過的蓋玻片表面均勻涂抹少量(約200μl)的APTES,室溫水平放置5 min；用ddH2O2沖洗2次，每次5 min；用0.5%戊二醛覆蓋蓋玻片表面，在室溫下培養(yǎng)30 min；除去廢液,用ddH2O2在搖床上清洗蓋玻片3次，每次5 min；用微量移液器吸取50μl的聚丙烯酰胺溶液滴于活化的蓋玻片上,迅速用一新的22 mm×22 mm蓋玻片蓋于聚丙烯酰胺凝膠上，聚合30 min；用鑷子將新蓋玻片揭下,用HEPES溶液在搖床上清洗蓋玻片表面15 min；除去凝膠基質(zhì)表面殘余液體,吸取Sulfo-SANPAN溶液均勻涂在凝膠基質(zhì)表面，120μl/片；置于30 W紫外燈下，離燈管15 cm處照射5 min,溶液活化后顏色會(huì)變暗紅。用HEPES溶液在搖床上清洗2次，每次15 min；除去基質(zhì)表面殘余液體，在基質(zhì)上均勻鋪0.2 mg/ml的I型膠原，100μl/片，4℃搖床過夜；用PBS清洗基質(zhì)2次，5 min/次；除去基質(zhì)表面殘余液體，在紫外燈下照射3～4h滅菌；接種細(xì)胞前，用完全培養(yǎng)基浸泡凝膠基質(zhì)并置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30～45 min，使其達(dá)到平衡。②聚丙烯酰胺凝膠楊氏模量的檢測：將制備好的聚丙烯酰胺凝膠溶液加入凝膠電泳的制膠槽中，制備出長度為100 mm，寬度為20 mm，厚度為1 mm的凝膠；將凝膠條的一端通過夾子固定，另一端用已知重量的夾子進(jìn)行垂直拉伸；在凝膠條自然垂直時(shí)做一標(biāo)記，得到初始長度l，用已知重量拉伸后再做一標(biāo)記，得到形變量△l；根據(jù)公式檢測凝膠條的楊氏模量：可以由初始長度l,形變量△l，凝膠條的截面積A和作用力F⊥根據(jù)公式Y(jié)=(F⊥/A)/(△l/l) 計(jì)算得到。③聚丙烯酰胺凝膠形狀一致性檢測：將制得的聚丙烯酰胺凝膠條紫外滅菌后浸泡在完全培養(yǎng)基中進(jìn)行孵育，分別在7 d和10 d對(duì)凝膠條的楊氏模量再次進(jìn)行測量，檢測其硬度是否隨著浸泡時(shí)間的延長發(fā)生明顯的變化。④聚丙烯酰胺凝膠生物相容性檢測：將制備好的聚丙烯酰胺凝膠浸泡在完全培養(yǎng)基中24 h，待凝膠與培養(yǎng)基達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后，棄去培養(yǎng)基，加入新培養(yǎng)基10 ml，在37℃，5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中浸泡48 h制備浸提液。將對(duì)數(shù)生長期MC3T3-E1細(xì)胞(5×104cells/ml)接種于96孔板中，200μl/孔。放入37℃，5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去舊培養(yǎng)基，分別加入上述制備好的浸提液200μl。放入37℃，5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，毎孔加入20μl的MTT試劑孵育4 h后，除去液體，每孔加入150μl的二甲基亞砜(DMSO)，多功能酶標(biāo)儀振蕩10 min后，檢測490 nm的吸光值。

3 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1由悉尼大學(xué)ANZAC研究中心饋贈(zèng),培養(yǎng)成骨細(xì)胞MC3T3-E1,使用含10%胎牛血清+1%雙抗+1%谷氨酰胺的α-MEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)于100 ml培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4 細(xì)胞形態(tài)檢測 取處于對(duì)數(shù)生長期的成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1，胰蛋白酶消化并計(jì)數(shù)，同時(shí)將制備好的凝膠基質(zhì)放入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分為Control(對(duì)照組)、Hard Gel(硬膠基質(zhì)組)和Soft Gel(軟膠基質(zhì)組)，每組5個(gè)復(fù)孔。接種MC3T3-E1細(xì)胞于3個(gè)組中，細(xì)胞接種密度為3×104個(gè)/孔，置于37℃，5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h,48 h，72 h，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。使用倒置顯微鏡對(duì)其細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察。使用圖像分析軟件Simple PCI對(duì)在不同硬度凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞的面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每組細(xì)胞隨機(jī)選取三個(gè)視野，每個(gè)視野隨機(jī)抽取20個(gè)細(xì)胞，然后用Simple PCI軟件統(tǒng)計(jì)每個(gè)細(xì)胞的面積，得到原始數(shù)據(jù)經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后進(jìn)行組間比較。

5 細(xì)胞增殖檢測 采用碘化丙啶(PI)染色進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)來檢測細(xì)胞增殖變化。具體步驟：取出培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，用1×PBS洗2次；用70%乙醇固定細(xì)胞，在4℃下固定1 h；1×PBS洗1次；加入PI染色液，4℃下避光染色30 min；將蓋玻片放在載玻片上，加入1～2滴抗熒光淬滅甘油進(jìn)行封片；將封好的片子放在熒光顯微鏡下觀察。

6 細(xì)胞礦化檢測 接種MC3T3-E1細(xì)胞于3個(gè)組(對(duì)照組、硬基質(zhì)組、軟基質(zhì)組)中，細(xì)胞接種密度為3×105個(gè)/孔，置于37℃，5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待各組細(xì)胞出現(xiàn)接觸抑制，更換誘導(dǎo)礦化細(xì)胞培養(yǎng)基。誘導(dǎo)礦化培養(yǎng)基每2天換一次，從出現(xiàn)細(xì)胞接觸抑制算起,到第10天停止誘導(dǎo)，用茜素紅染色法對(duì)礦化結(jié)節(jié)進(jìn)行染色。采用imageJ軟件掃描礦化結(jié)節(jié)進(jìn)行定量分析。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件Graphpad Prism5.0處理數(shù)據(jù),采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 細(xì)胞外基質(zhì)凝膠特性 通過調(diào)整丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的配比(丙烯酰胺濃度10%不變,甲叉雙丙烯酰胺濃度分別為0.03%，0.07%，0.13%)，可以顯著改變聚丙烯酰胺凝膠的硬度，獲得不同楊氏模量的凝膠基質(zhì) (附表)。

附表 丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺不同配比下的凝膠硬度

2 細(xì)胞外基質(zhì)凝膠生物相容性 將浸泡在完全培養(yǎng)基10 d的不同硬度下的聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)的浸提液用來培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞，正常培養(yǎng)48 h后觀察細(xì)胞形態(tài)沒有變化(圖1)。通過MTT比色法檢測聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)浸提液對(duì)成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞活性的影響(圖2),用不同硬度聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)浸提液培養(yǎng)成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞48 h后，其在490 nm處的吸光度值與對(duì)照組相比無顯著性差異，即不同硬度下的聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)浸提液均不會(huì)抑制細(xì)胞生長，無細(xì)胞毒性。

圖1 浸提液培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞

圖2 MTT比色法檢測聚丙烯酰胺凝膠浸提液的細(xì)胞毒性

3 細(xì)胞外基質(zhì)凝膠對(duì)成骨細(xì)胞形態(tài)的影響 在對(duì)照組、硬凝膠基質(zhì)和軟凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞，觀察細(xì)胞在24h、48h和72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的形態(tài)變化(圖3)。在對(duì)照組和硬凝膠基質(zhì)上生長的MC3T3-E1細(xì)胞多呈梭形或錐形，較為飽滿，鋪展情況良好；而在軟凝膠基質(zhì)上，細(xì)胞多呈長條形，不飽滿，鋪展情況不佳。

圖3 不同硬度基質(zhì)對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞形態(tài)的影響

4 細(xì)胞外基質(zhì)凝膠對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響 在不同的基質(zhì)硬度下，24h、48h和72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)上成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1的數(shù)目均有所增加。但在不同基質(zhì)硬度下，MC3T3-E1細(xì)胞的增殖情況是有差異的：在細(xì)胞培養(yǎng)板上，MC3T3-E1細(xì)胞數(shù)目的增長顯著，在三組中細(xì)胞增加數(shù)目最多；在硬凝膠基質(zhì)上，MC3T3-E1細(xì)胞數(shù)目的增加相對(duì)在細(xì)胞培養(yǎng)板上的較少(圖4)；在軟凝膠基質(zhì)上，MC3T3-E1細(xì)胞數(shù)目的增加最少。用Image J軟件分析以上圖片，統(tǒng)計(jì)MC3T3-E1細(xì)胞的個(gè)數(shù)，通過分析各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上細(xì)胞數(shù)，得到如圖5所示的結(jié)果。

圖4 不同基質(zhì)硬度對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響

P<0.05標(biāo)記為*，P<0.001標(biāo)記為***

5 細(xì)胞外基質(zhì)凝膠對(duì)成骨細(xì)胞礦化的影響 不同基質(zhì)硬度上培養(yǎng)成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞經(jīng)礦化誘導(dǎo)10d后，產(chǎn)生的礦化結(jié)節(jié)情況有很大的差異：在硬凝膠基質(zhì)表面培養(yǎng)的細(xì)胞，經(jīng)礦化誘導(dǎo)后染色，鈣結(jié)節(jié)明顯可見；在軟凝膠基質(zhì)表面培養(yǎng)的細(xì)胞，經(jīng)礦化誘導(dǎo)后染色，無明顯的鈣結(jié)節(jié)出現(xiàn)(圖6)。通過Image J軟件對(duì)細(xì)胞的礦化結(jié)節(jié)進(jìn)行面積的統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如圖7所示。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組與硬凝膠基質(zhì)組上細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)面積無顯著性差異，而軟凝膠基質(zhì)組上細(xì)胞礦化的總面積與對(duì)照組和硬凝膠基質(zhì)組均有顯著性差異(P<0.001)。

圖6 不同硬度基質(zhì)對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的影響

與對(duì)照組、硬基質(zhì)組比較，***P<0.001

圖7 不同硬度基質(zhì)對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)面積的影響

討 論

聚丙烯酰胺凝膠(PAM)是一種用途廣泛的具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的水溶性高分子聚合物，其物理化學(xué)性質(zhì)已進(jìn)行過很多深入的研究。本研究采用調(diào)整丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的濃度來改變聚丙烯酰胺凝膠的硬度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)整丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的配比，可以顯著改變聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)的硬度，并且隨著甲叉雙丙烯酰胺濃度的不同，聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)的硬度呈線性變化；MTT比色法驗(yàn)證了聚丙烯酰胺凝膠浸提液對(duì)細(xì)胞沒有毒性，說明聚丙烯酰胺凝膠具有良好的生物相容性。

細(xì)胞外基質(zhì)硬度對(duì)細(xì)胞生物學(xué)的影響十分廣泛，細(xì)胞形態(tài)、運(yùn)動(dòng)、生長增殖和分化都受到基質(zhì)硬度的影響[4-6]。本研究結(jié)果表明：MC3T3-E1細(xì)胞形態(tài)隨著凝膠基質(zhì)硬度的降低，其形狀由從梭形向長條形變化。細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)硬度越小，其鋪展面積也隨之減小。硬凝膠基質(zhì)和軟凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞，鋪展面積具有顯著性差異。 隨著培養(yǎng)基質(zhì)硬度的降低，MC3T3-E1細(xì)胞的增殖受到抑制；在硬基質(zhì)表面培養(yǎng)的細(xì)胞，經(jīng)礦化誘導(dǎo)后染色，鈣結(jié)節(jié)明顯可見；在軟基質(zhì)表面培養(yǎng)的細(xì)胞，經(jīng)礦化誘導(dǎo)后染色，無明顯的鈣結(jié)節(jié)出現(xiàn)；細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)的成骨細(xì)胞的礦化結(jié)節(jié)總面積最大，硬凝膠基質(zhì)表面的礦化結(jié)節(jié)總面積次之，軟凝膠基質(zhì)表面的結(jié)節(jié)總面積最小；且軟凝膠基質(zhì)表面礦化結(jié)節(jié)總面積與培養(yǎng)板和硬凝膠基質(zhì)上細(xì)胞礦化的面積相比差異具有顯著性。這些結(jié)果提示，不同基質(zhì)硬度可使成骨細(xì)胞的增殖和礦化發(fā)生變化，在硬基質(zhì)上細(xì)胞的增殖和礦化情況均優(yōu)于在軟基質(zhì)上細(xì)胞的增殖和礦化。

綜上所述，通過調(diào)整丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的配比，制備出硬度不同的聚丙烯酰胺凝膠，且證實(shí)聚丙烯酰胺凝膠相容性好,無細(xì)胞毒性。軟基質(zhì)凝膠抑制成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞的鋪展、細(xì)胞增殖和礦化結(jié)節(jié)形成。成骨細(xì)胞是骨形成的主要功能細(xì)胞,主要負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌以及礦化[7]。細(xì)胞外基質(zhì)硬度的不同可以看作是不同的力學(xué)刺激，在不同硬度基質(zhì)中培養(yǎng)成骨細(xì)胞則可研究力學(xué)刺激對(duì)細(xì)胞的影響[8]。因此研究成骨細(xì)胞對(duì)機(jī)械力的響應(yīng),探究其可能的響應(yīng)機(jī)制,對(duì)揭示病理生理過程、臨床的有效治療有著重要的意義。

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(收稿：2015-03-02)

細(xì)胞外基質(zhì) 軟骨寡聚基質(zhì)蛋白 成骨細(xì)胞 細(xì)胞增殖 細(xì)胞結(jié)構(gòu)

R329.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.10.010