TGF-β2和 TGF-βRⅡ在大鼠角膜堿燒傷中表達及意義

西安市兒童醫院眼科(西安710003)

劉彥芳 許 峰

?

TGF-β2和 TGF-βRⅡ在大鼠角膜堿燒傷中表達及意義

西安市兒童醫院眼科(西安710003)

劉彥芳 許 峰

目的：探討大鼠角膜堿燒傷后不同時期轉化生長因子β2(TGF-β2)及其Ⅱ型受體(TGF-βRⅡ)的表達及意義。方法：選擇60只SD大鼠，隨機分為兩組,其中A組為對照組,B組為實驗組,以右眼為實驗眼,建立大鼠角膜堿燒傷模型。每日裂隙燈下觀察角膜形態學的變化。分別于術后第1天、4天、7天、14天、21天、28天處死動物,行HE染色觀察炎細胞的浸潤情況,Masson 三色染色法觀察角膜基質層膠原纖維的排列和增殖情況。應用SABC法檢測各組角膜組織中PCNA陽性成纖維細胞的增殖情況,TGF-β2和TGF-βRⅡ的含量變化情況。結果：堿燒傷后第1、4天PCNA陽性成纖維細胞數低于正常；第7、14天，PCNA陽性成纖維細胞增加；此后呈現下降趨勢,但仍高于正常。堿燒傷后第4、7天TGF-β2和TGF-βRⅡ的表達明顯增加,此后逐漸下降,第28天時基本接近正常水平。結論：堿燒傷早期角膜瘢痕修復即已開始。堿燒傷后第4、7天TGF-β2和TGF-βRⅡ的分泌增加,兩者同步表達,變化趨勢一致。角膜瘢痕修復的病理過程與TGF-β2和TGF-βRⅡ分泌密切相關。

目前許多研究表明,轉化生長因子在機體的創傷修復、細胞生長和分化、細胞外基質的合成和貯存、胚胎發育、免疫調節等方面具有重要作用[1]。本實驗通過建立大鼠角膜堿燒傷模型,觀察堿燒傷后不同時期角膜組織轉化生長因子β2(TGF-β2)及其Ⅱ型受體(TGF-βRⅡ)的變化情況,為臨床合理地應用轉化生長因子抗體及轉化生長因子受體的抗體來防治角膜瘢痕提供理論依據。

材料與方法

1 材 料 健康、成年、雄性SD大鼠 60只(60 眼),體重 200～240g，來源于西安交通大學醫學院實驗動物中心,在清潔、通風、恒溫恒濕條件下飼養。將大鼠隨機分為兩組,其中A組為對照組(30只,30眼),B組為實驗組(30只,30眼),右眼為實驗眼,B組右眼建立大鼠角膜堿燒傷模型。

2 實驗方法 大鼠角膜堿燒傷模型的制作,見參考文獻[2]。分別于堿燒傷后第1、4、7、14、21、28天時處死大鼠,取A、B組各5只大鼠,剜出右眼,于顯微鏡下剪下帶1mm寬鞏膜的角膜組織,剝除虹膜組織,勿損傷角膜內皮,將角膜置于甲醛中固定,48h后取出,常規脫水、透明蠟、包埋、切片。分別行HE染色、Masson染色和SABC法檢查增殖細胞核抗原(PCNA)、TGF-β2和 TGF-βRⅡ的含量。圖片采用Motic Med 6.0數碼醫學圖像分析系統進行分析。在物鏡放大倍數為 20×20的條件下測定,在每張切片中,隨機測定數個視野的陽性染色密度,結果為其中隨機5個視野的均值。

結 果

1 HE染色及Masson染色 堿燒傷術后第1天,角膜上皮脫落,出現片狀缺損,前基質層出現淺層潰瘍,角膜水腫,混濁,基質層增厚,角膜緣出現炎性細胞浸潤；第4～7天基質層潰瘍加深,角膜水腫,混濁明顯加重,基質層膠原纖維排列紊亂,其中可見大量炎性細胞及成纖維細胞增生；第14天角膜水腫,混濁有所減輕,基質層膠原纖維排列仍紊亂,炎性細胞浸潤較前有所減輕,可見大量增生的成纖維細胞；第21～28天,角膜潰瘍逐步形成瘢痕修復,基質纖維相互交聯,排列紊亂,成纖維細胞增生活躍,未見明顯炎性細胞浸潤。

2 PCNA免疫組化結果 見表1。PCNA主要位于細胞核內,細胞核內有棕黃色顆粒為PCNA 陽性。實驗組與對照組的PCNA陽性成纖維細胞數比較：第1天及第4天實驗組較對照組明顯減少(P<0.05)；第7天及14天實驗組較對照組明顯增高(P<0.05)；第21天及第28天實驗組較對照組差異無統計學意義(P>0.05)。

3 TGF-β2的免疫組化結果 見表2。實驗組與對照組比較，第1天實驗組較對照組差異無統計學意義(P>0.05)；第4天及第7天實驗組較對照組明顯增高(P<0.05)；第14天、第21天及第28天實驗組較對照組差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 角膜組織中PCNA陽性成纖維細胞數

表2 TGF-β2的免疫組化染色結果

4 TGF-βRⅡ的免疫組化結果 見表3。實驗組與對照組比較，第1天實驗組較對照組差異無統計學意義(P>0.05)；第4天及第7天實驗組較對照組明顯增高(P<0.05)；第14天、第21天及第28天實驗組較對照組差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 TGF-βRⅡ的免疫組化染色

討 論

堿燒傷后角膜損傷的修復主要是瘢痕修復，成纖維細胞的大量增殖與凋亡抑制、膠原的合成與降解失衡、大量細胞因子的產生是瘢痕形成的主要原因。已有研究表明[3],在參與創傷修復的大量細胞因子中,TGF-β是調控膠原合成的最關鍵因子, 它已被公認為器官纖維化的治療靶標。在轉化生長因子的各種亞型中,TGF-β2在眼部具有主要作用。TGF-β2可通過自分泌和(或)旁分泌形式對多種細胞的分裂、增殖和轉化起作用。對大部分眼部組織的病理和生理起調節作用。

TGF-β的生物學效應是通過與其在細胞膜上的受體TβR相結合實現的。其中，TβRI和TβRⅡ廣泛存在，介導TGF-β主要的生物學功能。一般認為,TGF-β首先直接與TβR-Ⅱ結合,形成復合物,此時TGF-β構象改變,被TβR-Ⅰ所識別并結合形成TβR-Ⅱ-TGF-β-TβR-Ⅰ三聚體復合物,復合物中的TβR-Ⅰ被TβR-Ⅱ磷酸化,磷酸化的TβR-Ⅰ將信號放大并進一步向后傳遞。

PCNA為DNA聚合酶δ的輔助蛋白。目前,許多研究發現,PCNA與細胞核DNA的合成關系密切，通過與功能蛋白結合，轉換、調控、啟動細胞增殖,是反映細胞增殖狀態的主要指標之一[4]。本實驗結果示,堿燒傷后第1、4天PCNA陽性成纖維細胞數低于正常；第7、14天，PCNA陽性成纖維細胞增加；此后呈現下降趨勢，但仍高于正常。在正常的角膜組織中，TGF-β2表達于上皮組織中，角膜上皮層的基底細胞層可見棕色顆粒散布于細胞漿和細胞膜上以及基底膜上。當角膜的完整性受到破壞時，TGF-β2進入角膜基質中，誘導纖維化修復反應。TGF-βⅡ型受體在正常角膜組織中主要分布在角膜上皮細胞的細胞膜,呈深黃色。在TGF-β誘導的信號轉導中,TβR-Ⅱ通過自身磷酸化將信號轉導下去。堿燒傷后第4、7天TGF-β2 和TGF-βRⅡ的表達明顯增加,此后逐漸下降，第28天時基本接近正常水平。由此我們可見,TGF-β2及TGF-βRⅡ兩者同步表達,變化趨勢一致。兩者可以有效結合,介導活性TGF-β2的生物學效應,促進成纖維細胞的增殖,刺激膠原纖維的產生,使損傷組織發生纖維化修復。

本研究通過建立大鼠角膜堿燒傷模型,發現堿燒傷后第7天TGF-β2和TGF-βRⅡ的分泌達高峰,兩者同步表達，變化趨勢一致。進一步說明TGF-β2及TβRⅡ在角膜堿燒傷瘢痕修復中起著重要作用,用其相應的抗體可有效的抑制角膜瘢痕的形成,對于堿燒傷的治療具有重要價值。但如何合理有效地應用相應抗體有待于我們進一步研究。

[1] 譚龍益,孔憲濤.轉化生長因子β受體的研究進展[J].國外醫學臨床生物化學與檢驗學分冊,2013,8(2)：63-66.

[2] 顧宏衛,胡 楠.大鼠角膜堿燒傷模型制備方法的研究[J].國際眼科雜志,2013,13(6)：1093-1095.

[3] Cordeiro MF,Reichel MB.TGF-β1,β2,β3 in vivo：effect on normal and mitomycin C-modulated conjunctival scar-ring[J].Invest Ophalmol Vis Sci,2011,40(9)：1975-7982.

[4] 趙魯笳,邢廣塋,王美華,等.進展期胃癌P53 蛋白和PCNA/cyclin的表達[J].大連醫科大學學報,2011,33(3)：220-223.

(收稿：2015-01-20)

角膜 眼燒傷 轉化生長因子β2 受體,轉化生長因子β

R779.12

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.10.009