組織蛋白酶D、微血管密度在上皮性卵巢腫瘤中的表達及意義*

陜西省腫瘤醫院婦瘤科(西安710061)

韓志紅 方曉荷△ 田小飛

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組織蛋白酶D、微血管密度在上皮性卵巢腫瘤中的表達及意義*

陜西省腫瘤醫院婦瘤科(西安710061)

韓志紅 方曉荷△田小飛

目的：檢測組織蛋白酶D(Cath-D)、微血管密度(MVD)在上皮性卵巢腫瘤中的表達，探討其與卵巢癌細胞組織分化、增殖、侵襲及轉移的關系。方法：用Cath-D抗體標記上皮性卵巢腫瘤組織標本，綜合染色強度和陽性細胞占總體細胞數的百分比進行染色判定，用CD34標記血管內皮進行微血管計數，再結合有關病理特征進行分析。結果：Cath-D、MVD均值在上皮性卵巢癌中的表達與年齡、病理類型無相關性，而與卵巢癌的臨床分期、有無轉移及腹水呈正相關，且Cath-D與卵巢癌的組織學分級呈正相關，Cath-D與MVD的表達具有正相關性。結論：Cath-D及MVD參與上皮性卵巢癌的發生發展過程，并在其侵襲轉移及生長過程中發揮了重要的協同作用。

侵襲和轉移是引起卵巢癌患者死亡的主要原因，血管生成是腫瘤生態系統中的一個重要因素，參與腫瘤的生物學行為。本研究主要探討Cath-D與MVD在上皮性卵巢腫瘤中的表達情況及其與卵巢癌細胞侵襲轉移、組織分化與增殖的關系，探尋其在卵巢癌早期診斷中的作用，并為抗癌藥物的研究提供新靶點。

材料與方法

1 材 料 本研究的標本取自2002年5月至2006年3月在陜西省腫瘤醫院接受初次手術治療的患者共62例，標本經福爾馬林固定，石蠟包埋，所有標本均經術后病理檢查證實，術前均無化學藥物治療及毒物、藥物、放射線、煙酒等危險因素接觸史，其中惡性組40例，良性組12例，交界惡性4例，正常組織6例。按國際婦產科協會(FIGO)2004年分期標準，Ⅰ期8例，Ⅱ期10例，Ⅲ期11例，Ⅳ期11例；按組織病理分級，1級2例 ，2級23例，3級15例；按組織學類型分類(WHO1998年分類法)，漿液性26例，粘液性18例。良性卵巢上皮性腫瘤共12例，漿液性6例，粘液性6例。正常卵巢6例作為對照組，均來自因子宮肌瘤行全宮切除術同時切除卵巢的病例。鼠抗人組織蛋白酶D單克隆抗體、鼠抗人原始造血細胞(CD34)單克隆抗體均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

2 方 法 ①免疫組織化學染色SP法(鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化酶連接法)：石蠟切片脫蠟至水,PBS緩沖液沖洗，抗原熱修復后加過氧化酶阻斷溶液,PBS沖洗后再加入非免疫性動物血清，室溫孵育10 min加入第一抗體，4℃過夜。PBS沖洗后加生物素標記的第二抗體,室溫孵育10min后PBS沖洗，再加入鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液,室溫孵育10 min,PBS沖洗后滴加新鮮配置的DAB溶液，顯微鏡下觀察3～10 min。自來水沖洗，復染,脫水,封片。用PBS緩沖液代替一抗作為空白對照。②結果判定：Cath-D的陽性判斷標準為：凡細胞胞質內出現棕色顆粒為陽性，雙盲法隨機選5個高倍(400倍)視野計算100個細胞中陽性細胞數，陽性細胞>50%為陽性表達，<50%為陰性表達。MVD計數標準參考Weidner的矯正計數法：以被CD34染成棕黃色的單個內皮細胞或內皮細胞簇為一個血管標記，凡管腔大于8個紅細胞的血管均不計數，先在低倍鏡下(100倍)選取5個微血管最密集的區域，再在高倍鏡(400倍)下計數每個區域微血管數量，以平均值表示每例的MVD值[1]。

3 統計學方法 應用SPSS13.0統計分析軟件，Cath-D采用χ2檢驗。MVD采用t檢驗，Cath-D與MVD的相關關系采用相關性分析，取α=0.05作為檢驗水準。

結 果

1 Cath-D及MVD在正常卵巢組織及上皮性卵巢腫瘤中的表達情況 Cath-D染色陽性物質呈棕黃色細顆粒，主要定位在卵巢癌的癌細胞和間質細胞的的細胞漿和細胞膜中，細胞核不著色(見附圖)。其表達在惡性組最高，良性組最低，惡性組分別與正常組、良性組、交界性組間有顯著性差異(P<0.05)。CD34標記的MVD陽性表現為棕黃染色，在癌組織或癌周均可見，但在癌周特別豐富(見附圖)，MVD均值在良性組與交界及惡性組之間有顯著性差異(P<0.05)。

2 Cath-D、MVD的表達與上皮性卵巢癌臨床病理參數的關系 Cath-D在卵巢腫瘤中的表達與年齡和組織學類型無明顯關系(P>0.05)；而在FIGO分期晚(Ⅲ～Ⅳ期)、組織學分化程度低、體內有腹水或發生轉移病例中其表達程度增高，其間有顯著性差異(P<0.05)。而MVD的表達與組織學分級無關(P>0.05)，見附表。

A：Cath-D在卵巢漿液性囊腺癌中的表達(10×40倍)；B：Cath-D在卵巢粘液性囊腺癌中的表達(10×40倍)；C：MVD在卵巢漿液性囊腺瘤中的表達(10×10倍)；D：MVD在卵巢粘液性囊腺瘤中的表達(10×10倍)

附圖 上皮性卵巢癌中Cath-D、MVD的陽性表達(免疫組化SP法)

附表 Cath-D的表達與卵巢癌中的陽性表達與臨床病理指標間的關系

3 Cath-D和MVD表達的相關性 在Cath-D表達陰性的21例上皮性卵巢癌和Cath-D表達陽性的19例上皮性卵巢癌中，MVD均值具有表達的正相關性，并具有顯著性差異(P<0.05)。

討 論

Cath-D是一種天門冬氨酸肽鏈內切酶，編碼基因位于染色體11p15，廣泛存在于脊椎動物、真菌、反轉錄病毒和一些植物病毒中。人體正常組織均能合成Cath-D，其正常功能是在溶酶體的酸性pH環境下分解蛋白質，它也有類似生長因子的作用。除此以外，有研究表明，Cath-D與細胞凋亡密切相關[2]。有報道在胃癌、結腸癌、膀胱癌、腎癌、乳腺癌、腦星形膠質細胞瘤和各種婦科腫瘤等惡性腫瘤中都曾發現Cath-D的過表達與惡性腫瘤的臨床分期、病理分級和腫瘤浸潤程度以及復發有相關聯系[3-4]。因此如何利用Cath-D來預防和治療癌癥給人類帶來新的思考[5]。

本研究結果顯示：Cath-D的表達與卵巢癌的FIGO分期、組織學分化程度、有無轉移及有無腹水有關，臨床分期越高、組織學分化程度越低Cath-D的表達越強，發生轉移及產生腹水者其Cath-D表達程度增強。提示Cath-D參與了卵巢癌的侵襲、轉移過程。Cath-D促進腫瘤進展、浸潤轉移的可能機制是：過表達的Cath-D激活蛋白質水解級聯反應，降解基底膜的多種組織成分，使基底膜破壞，腫瘤細胞穿過基底膜從而浸潤轉移，可以以同樣的方式溶解血管的基底膜進入血管，從而發生遠處轉移。既往有報道在上皮性卵巢腫瘤中，有組織蛋白酶B、基質金屬蛋白酶等溶酶體酶類的活躍表達，因此Cath-D是與其它溶酶體酶類協同發揮作用。

許多學者將MVD作為腫瘤血管形成程度的標志和腫瘤的生物學特征[6]，可作為腫瘤轉移的預測因子及判斷預后的指標[7]。關于MVD的測定及其與腫瘤生長、病理分期、轉移及預后有關，本研究顯示，MVD表達與卵巢癌的FIGO分期、有無轉移及有無腹水有關，臨床分期越高MVD的表達越強，發生轉移及產生腹水者其MVD表達程度增強，而與組織學分級沒有明顯關系。由本研究的結果和以往多位學者的報道我們推測，血管生成為腫瘤細胞的生長提供營養和氧氣。微血管密度增高是腫瘤整體血管面積增大，腫瘤細胞進入血道或淋巴結循環的機會增大，從而使遠處轉移的機會增大。MVD 的檢測不僅能反映卵巢癌組織內血管的數量，還能反映卵巢癌細胞生長和轉移的能力，有助于深入了解腫瘤發生、發展和轉移的機制，是判斷卵巢癌患者預后的一項有用指標。除此之外，MVD還為抗腫瘤血管生成治療提供理論基礎，如果能找到抑制和阻斷血管形成的途徑，就可使原發的甚至轉移的腫瘤得到有效的控制，將對惡性腫瘤的治療提供一種新的途徑。

在Cath-D表達陽性的上皮性卵巢腫瘤組織中，MVD均值較Cath-D表達陰性的腫瘤組織中高，用統計軟件對Cath-D和MVD之間進行相關性分析，發現二者有正相關性。這兩項指標之間的調控機制目前尚不甚清楚，認為可能是Cath-D刺激腫瘤細胞釋放堿性成纖維細胞生長因子所致。

綜上所述，過表達的Cath-D和MVD可促進上皮性卵巢癌的發生和發展，有利于上皮性卵巢癌的浸潤和轉移，可以判斷上皮性卵巢癌的惡性程度、生物學行為及預后， Cath-D、MVD的表達在上皮性卵巢癌的分化、侵襲、轉移和臨床進展過程中可能起著重要調節作用，為研究上皮性卵巢癌的發病機制、侵襲轉移、預測預后以及探討治療提供了一種新的途徑。

[1] Foote RL,Weidner N,Harris J,etal.Evaluation of tumor angiogenesis measured with microvessel density (MVD) as a prognostic indicator in nasopharyngeal carcinoma: results of RTOG 9505[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys,2005,61(3)：745-753.

[2] Kagedal K,Johansson U, Ollinger K.The lysosomal protease cathepsin D mediates apoptosis induced by oxidative stress[J]. EMBO,2001,15：1592-1594.

[3] Ruibal A,Herranz M, Arias JI. Clinical and Biological Significance of Cathepsin D Levels in Breast Cancer Cytosol in Women Over 70 years[J].Biomark Cancer,2012,8(4)：1-6.

[4] Mimae T,Tsuta K,Maeshima AM,etal.Cathepsin D as a potential prognostic marker for lung adenocarcinoma[J]．Pathol Res Pract,2012,208(9)：534-540.

[5] Achour O,Bridiau N,Kacem M,etal．Cathepsin D activity and selectivity in the acidic conditions of a tumor microenvironment：Utilization in the development of a novel Cathepsin D substrate for simultaneous cancer diagnosis and therapy[J]．Biochimie,2013,95(11)：2010-2017.

[6] Scappaticci FA. Mechanisms and future directions for angiogenesis-based cancer therapies[J]. Clinical Oncology,2002,20(18)：3906-3927.

[7] Romanenko AM,Ruiz-Saurí A,Morell-Quadreny L,etal.Microvessel density is high in clear-cell renal cell carcinomas of ukrainian patients exposed to chronic persistent low-dose ionizing radiation after the Chernobyl accident[J].Virchows Archiv,2012,460(6)：611-619．

(收稿：2015-06-08)

*陜西省自然科學基礎研究項目(S2013JC10400)

卵巢腫瘤 組織蛋白酶D 微血管密度 腫瘤轉移

R737.33

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.10.007

△廣東省深圳市寶安區婦幼保健院婦產科