Hedgehog通路介導的白藜蘆醇對胰腺癌Miapaca-2細胞增殖與凋亡的影響*

西安市中心醫院普外二科(西安 710004)

秦 勇 杜 虹 馬清涌 曹 佩 熊紅艷 黨曉燕▲

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Hedgehog通路介導的白藜蘆醇對胰腺癌Miapaca-2細胞增殖與凋亡的影響*

西安市中心醫院普外二科(西安 710004)

秦 勇 杜 虹 馬清涌 曹 佩 熊紅艷 黨曉燕▲

目的：體外觀察白藜蘆醇(Res)對人胰腺癌Miapaca-2(PC-2)細胞生長及Hedgehog信號通路的影響。方法：3種不同濃度的白藜蘆醇分別體外作用人胰腺癌PC-2細胞,采用流式細胞儀檢測細胞凋亡,MTT法檢測細胞增殖；同時通過實時定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)和Western bolt分析測定PC-2細胞Ihh、Ptch和Smo mRNA及蛋白的表達。結果：3個濃度組白藜蘆醇可顯著促進胰腺癌PC-2細胞凋亡,且呈濃度依賴關系,與陰性對照組相比,差異有統計學意義(P<0.01)；其中高濃度組白藜蘆醇的集落個數明顯減少,與5-FU組比較差異有統計學意義(P<0.01)；3個濃度組白藜蘆醇對胰腺癌PC-2細胞的增殖呈明顯抑制作用,且抑制效應具有濃度效應和時間效應；與陰性對照組相比,差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；3個濃度組白藜蘆醇作用于PC-2細胞后，Hedgehog信號通路中Ihh、Ptch、Smo 蛋白和mRNA水平低于陰性對照組,差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01),表達水平隨著白藜蘆醇濃度增加而逐漸降低。結論：白藜蘆醇可促進胰腺癌PC-2細胞凋亡,抑制其增殖,其機制可能與其抑制Hedgehog信號通路中Ihh、Ptch和Smo的表達相關。

胰腺癌是消化道常見惡性腫瘤,位居腫瘤死因第4位,傳統的化療和放療效果較差是胰腺癌目前預后不佳的主要原因，胰腺癌患者的5年生存率大約是5%，大多數患者的生存時間甚至不超過診斷后第一年[1-2]。有關胰腺癌一些新的治療策略,如抑制信號通路治療，基因和免疫治療等應用于臨床。成熟組織中Hedgehog通路不表達或表達水平低。Hedgehog通路在胰腺癌組呈現高水平的表達[3-4],成為胰腺腫瘤的研究熱點。白藜蘆醇(Resveratrol,Res)為存在于幾十種植物中的多酚類化合物,尤其在中藥虎杖根中含量豐富,其具有較強的抗氧化作用,成為正在開發的新一代抗氧化應激植物藥[5]。Res體外對乳腺癌細胞和胃癌細胞等腫瘤可顯著抑制其增殖[6]。但Res體外對胰腺癌細胞增殖、凋亡的影響以及對Hedgehog信號通路的機制尚不清楚。本課題研究Res體外干預胰腺癌細胞,觀察其對胰腺癌細胞PC-2增殖和凋亡的影響,以及對Hedgehog信號通路的作用,為胰腺癌的治療提供一種新的治療策略。

材料與方法

1 材 料 人胰腺癌細胞株PC-2(北京協和醫學院),Res(美國Sigma公司),5-FU注射液(上海旭東海普公司),凋亡試劑盒(珠海健康元生物醫藥有限公司),DMEM 培養基和胰蛋白酶(Hyclone公司),MTT(美國Sigma公司),孔板(Costar公司)；cDNA合成試劑盒(北京 Norellhin DE科技有限公司),Ptch、Smo、Ihh 一抗及相應二抗(美國sant cruz公司)；PCR MasterMix(Takara公司產品)；引物序列由Takara公司合成。

2 方 法 ①細胞培養及分組細胞培養：人胰腺癌PC-2細胞在37℃,5% CO2條件下,用含10%小牛血清、青霉素100 IU/ml、鏈霉素100 mg/L及1% L-谷氨酰胺的DMEM培養液傳代培養,培養至70%～80%融合時,用2.5 g/L胰酶消化傳代繼續培養。實驗分為：高濃度Res組、中濃度Res組、低濃度Res組、5-FU組和陰性對照組。高、中和低Res濃度組Res濃度分別為200μmol/L、100μmol/L、50μmol/L。5-FU組5-FU濃度為0.75 mg/ml。②流式細胞儀檢測Res處理后細胞的調亡：取對數期胰腺癌PC-2細胞,調整細胞懸液濃度,接種于25 ml培養瓶,待細胞貼壁后加藥,按實驗分5組。24 h后終止藥物干預,常規消化細胞,1500轉離心5 min,用PBS洗一遍,再重復離心1次,按試劑盒操作說明依次加入binding buffer 500μl,Annexin-v 5μl,PI 10μl,避光10 min用流式細胞儀檢測凋亡率,PI(-) Annexin-V(+)為早期凋亡率。本實驗重復3次。③Res處理后PC-2細胞集落的形成：對數生長期的胰腺癌PC-2細胞消化后吹打成單細胞懸液。將200個細胞接種24孔板中并分散均勻。待細胞貼壁后加藥,按實驗分5組。每組5個復孔。37℃、5% CO2孵箱中培養6 d至細胞形成典型集落后終止。顯微鏡下觀察,以包含50個以上細胞為一個集落,甲醇固定,結晶紫染色并計數。集落形成率=集落個數/接種細胞數。集落抑制率(%)=(1-用藥組集落數/對照組集落數)×100%。④檢測Res處理后PC-2細胞的增殖：胰酶消化PC-2細胞,調整濃度為1×108/L,接種到96 孔板,約6×103/孔,細胞貼壁生長融合。然后將細胞分5組，每組100μl設5個復孔。培養24、48、72 h分別檢測并倒置顯微鏡下觀察。檢測前加入MTT(5 g/L)20μl/孔,培養4 h去上清,加入DMSO,室溫振蕩10 min,酶標免疫測定儀于490 nm 波長測定吸光度值。細胞抑制率=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100%。⑤檢測Ihh、Ptch和Smo蛋白含量：分別提取藥物干預24 h的5組細胞總蛋白,12%聚丙稀酰胺凝膠中電泳,蛋白轉移至硝酸纖維膜上,脫脂奶粉封閉后分別與抗β-actin、Ihh、Ptch及Smo單克隆抗體雜交,然后與相應的二抗反應,陽性條帶用化學發光法檢測,引物序列見表1。⑥RT-PCR檢測Ihh、Ptch、Smo mRNA的表達：按上述分組Res干預24 h后,采用Trizol Reagent試劑盒提取PC-2細胞總RNA，之后RNA轉錄為cDNA。PCR反應體系為25μl,內含cDNA產物2μl,正、反義引物各1μl( 10μm),2×Taq PCR MasterMix 12.5μl,加ddH2O(滅菌去離子水) 8.5μl至總反應體積25μl。PCR 反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；結束前72 ℃延伸7 min。陰性對照用滅菌去離子水替代總RNA進行逆轉錄和PCR擴增。分別取PCR產物9μl,加10×Loading Buffer 1μl,經2.5%瓊脂糖凝膠(含EB 0.15 mg/L ) 電泳,電壓為40 V,時間40 min,用紫外透射分析儀觀察并拍照。通過GIS22009全自動數碼凝膠圖像分析系統分析各條帶的光密度,β-actin作為內參基因評估各組細胞中基因Ihh、Ptch、Smo mRNA的相對表達量。

表1 引物序列

3 統計學方法 實驗數據錄入計算機中，SPSS16.0 軟件分析。數據用均數±標準差表示。兩組比較使用獨立樣本均數t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 Res處理對PC-2細胞凋亡的影響 見表2。Res對胰腺癌細胞凋亡具有明顯的促進作用，與陰性對照組相比差異均有統計學意義(P<0.05)，3個濃度組間相關分析顯示呈濃度效應關系。

表2 各組細胞凋亡率

注：與陰性對照組比較，*P<0.05

2 Res處理后對PC-2細胞集落形成的影響 見表3。經Res處理后,PC-2細胞集落形成的個數明顯減少，高、中、低濃度組的集落形成與陰性對照組相比,差異有統計學意義(P<0.01)；高濃度組與其余組相比，集落個數明顯減少，差異有統計學意義(P<0.01)。Res隨著濃度增加，集落形成數明顯減少，相關分析顯示呈劑量效應關系。

表3 Res處理后對PC-2細胞集落形成的影響

注：與陰性對照組比較，*P<0.05；與5-FU組比較，○P<0.01；與低濃度Res組比較，△P<0.01；與中濃度Res組比較，▲P<0.01

3 Res處理后對PC-2細胞增殖的影響 見表4。Res作用24、48、72 h，高、中、低濃度組均對PC-2細胞增殖呈現明顯的抑制作用，與陰性對照組相比差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，并且該抑制作用呈濃度與時間依賴效應關系。說明Res對胰腺癌細胞的增殖具有明顯的抑制作用，并隨濃度增大及時間延長而增強。顯微鏡觀察：藥物處理后，各藥物組細胞貼壁不牢，細胞變形，核固縮，培養基中懸浮細胞增多，可見大量細胞碎片(圖1)。

表4 不同濃度Res在各時間點對PC-2細胞增殖的影響

注：與陰性對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與5-FU組比較，○P<0.01；與低濃度組比較，△P<0.01；與中濃度組比較，▲P<0.01

圖1 不同濃度Res干預前及干預后48h鏡下圖片(10×10倍)

4 Res對PC-2細胞Ihh、Ptch和Smo 蛋白表達量的影響 見表5，圖2。Res作用PC-2細胞24 h，western blot方法檢測PC-2細胞內Ihh、 Ptch及Smo蛋白含量，與陰性對照組比較，3個不同濃度Res組和5-FU組的Ihh、Ptch和Smo蛋白含量均降低(P<0.05或P<0.01)，且Res三組對蛋白的降低程度采用相關分析顯示呈濃度依賴效應關系。

(1.Res高濃度組；2.Res中濃度組；3.Res低濃度組；4.5-FU組；5.陰性對照組)

圖2 Res對PC-2細胞Ptch、 Smo及Ihh蛋白表達的影響

5 Res對PC-2細胞Ihh、Ptch及Smo 的mRNA表達的影響 見表6。

表5 Res對PC-2細胞Ptch、Smo及Ihh蛋白表達的影響

注：與陰性對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與5-FU組比較，○P<0.05，○○P<0.01；與低濃度組比較，△△P<0.01；與中濃度組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

表6 Res干預PC-2細胞24 h后Ihh、Ptch、Smo mRNA相對表達水平

注：與陰性對照組比較，*P<0.01；與5-FU組比較，○P<0.01；與低濃度組比較，△P<0.01；與中濃度組比較，▲P<0.01

各濃度組Res干預PC-2細胞后，采用實時定量PCR法檢測Ihh、Ptch和Smo mRNA的表達。結果發現與陰性對照組比較, Ihh、Ptch、Smo mRNA的表達明顯低于陰性對照組，差異有顯著性(P<0.01)，并且在3組間隨著濃度增加表達水平逐漸降低。

討 論

胰腺癌以發病隱匿，預后差為其特點，確診時往往已為中晚期，手術效果不理想，目前大多采用放、化療等治療手段，尚無特效藥物治療。近年研究證實Hedgehog信號通路高表達于胰腺癌組織或細胞，和腫瘤發生及發展密切相關[7]。

腫瘤的發生取決于腫瘤細胞增殖和凋亡這一動態平衡是否破壞。本實驗通過三種不同濃度白藜蘆醇分別作用于體外常規培養人胰腺癌PC-2細胞，采用流式細胞儀和MTT法檢測細胞凋亡和增殖發現，Res對胰腺癌細胞凋亡具有明顯促進作用，隨濃度增加凋亡率明顯增高。高、中、低濃度組Res對PC-2細胞增殖均呈明顯著抑制作用，并隨濃度增大、時間延長而增強。給予Res處理后，隨藥物濃度的增加，作用時間的延長，培養基中懸浮的細胞增多，細胞碎片增多，說明Res具有顯著抑制PC-2細胞增殖。證實了Res抑制PC-2細胞增殖，對凋亡起促進作用，其有效抑制了胰腺癌細胞的生長。

Hedgehog是重要的參與組織分化、細胞增殖的信號通路，Hh通路上的Smo蛋白是發揮轉換器作用的膜蛋白,胞外Hh信號通過Smo轉換為胞內Gli信號，從而激活Bcl-2等基因，起到改變細胞凋亡的作用。通過siRNA抑制乳腺癌MCF-7細胞、胃癌MGC803細胞、胰腺癌PANC-1細胞中Smo和Gli1的表達, 可以抑制腫瘤細胞的增殖，誘導細胞凋亡[7]。Hedgehog信號轉導通路與胰腺癌發生發展密切相關。Yang等[8]發現胰腺癌組織中Ihh、Ptch及Smo蛋白表達均呈高水平，而正常胰腺導管中卻均未見表達。本實驗發現Res干預PC-2細胞24 h后，Ihh 、Ptch和Smo的mRNA及蛋白表達明顯低于陰性對照組，且三組間隨著濃度增加表達相應降低。說明Res可有效降低PC-2細胞Ihh、Ptch及Smo的表達，從而阻斷Hedgehog信號通路。 綜上所述，Res可促進PC-2細胞凋亡、抑制細胞增殖，對胰腺癌細胞生長起到抑制作用，可能通過下調Hedgehog信號通路中Ihh、Ptch及Smo的表達，阻斷Hedgehog信號通路而發揮作用。隨著不斷深入研究Hedgehog通路在胰腺癌發生發展中的作用，Res有望成為治療胰腺癌的新選擇。

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(收稿：2015-01-09)

*陜西省科學技術研究發展計劃項目(2011K13-01-15)

胰腺腫瘤 細胞增殖 細胞凋亡 @白藜蘆醇 @Hedgehog信號通路

R735.9

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.10.005

▲通訊作者：西安交通大學第二附屬醫院急診科