Survivin、COX-2蛋白在骨肉瘤中的表達及其臨床意義*

陜西省人民醫院骨科(西安710068)

段大鵬 秦 靜 王曉慶 劉 軍 范亞一 李 勇▲

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Survivin、COX-2蛋白在骨肉瘤中的表達及其臨床意義*

陜西省人民醫院骨科(西安710068)

段大鵬 秦 靜 王曉慶 劉 軍 范亞一 李 勇▲

目的：檢測骨肉瘤活檢標本中COX-2與Survivin蛋白的表達水平,并分析其與骨肉瘤臨床病理特征之間關系。方法：收集新鮮切除并經臨床病理學確診的骨肉瘤標本30例、骨軟骨瘤標本20例。其中骨肉瘤標本按臨床分期標準,Ⅰ期7例,Ⅱ期14例,Ⅲ期9例。采用免疫組織化學方法和Western blot法檢測骨肉瘤組織、骨軟骨瘤組織及正常組織中COX-2及Survivin蛋白表達。結果：Survivin 和COX-2蛋白主要表達于細胞質中，在骨肉瘤和骨軟骨瘤組織中的表達分別為63.3%和73.3%、30.0%和25.0%；Spearman等級相關分析表明,在骨肉瘤組織中,Survivin與COX-2蛋白表達水平為正相關關系(r=0.775，P<0.05)。Western blot結果顯示，骨肉瘤組織中Survivin和COX-2蛋白表達水平顯著高于骨軟骨瘤組織及正常組織組(P<0.05)；SPSS13.0統計軟件分析結果,未見Survivin和COX-2蛋白表達與骨肉瘤年齡、病理分級和類型之間存在顯著相關性。結論：Survivin與COX-2蛋白在骨肉瘤組織中高表達，且二者呈正相關關系,表明Survivin與COX-2可能在骨肉瘤的發生發展中起重要作用。

骨肉瘤是兒童和青少年最常見的惡性骨腫瘤，患者常死于晚期遠處轉移，因此尋找一種能夠指導臨床治療并提示預后的生物標志物非常重要[1]。Survivin為細胞凋亡抑制蛋白家族成員，在凋亡的基因調控中發揮重要作用[2]。COX-2常高表達于肉瘤組織,被認為是指導輔助治療和判斷預后的指標之一[3]。本研究采用免疫組織化學方法和Western blot法檢測活檢標本中COX-2與Survivin蛋白的表達，并分析其與骨肉瘤臨床病理特征之間的關系。

材料與方法

1 材 料 收集我院2011年5月至2013年5月新鮮切除的腫瘤組織標本共50例，所有患者均知情同意。根據美國癌癥聯合委員會TNM分期系統進行分類。其中骨肉瘤標本30例,骨軟骨瘤標本20例；男37例,女13例；年齡5～31歲，平均年齡13.25±3.22歲；按骨肉瘤臨床分期標準,Ⅰ期7例,Ⅱ期14例,Ⅲ期9例。將所有外科手術切除的新鮮標本,冰鹽水沖洗,切取數塊,一部分放入凍存管立即置于-80℃冰箱中,另一部分放入70%冷乙醇中固定備用。

2 方 法 ①免疫組織化學染色：4%多聚甲醛常規固定,取材并置20%蔗糖溶液中過夜,蠟塊制作、切片；0.3%過氧化氫甲醇溶液30 min,PBS清洗；加配好的0.3%Triton X-100 30 min,PBS清洗；加血清稀釋液稀釋的一抗,4℃ 24～48 h,吸去抗體,PBS清洗；加PBS稀釋的的二抗,室溫孵育2 h,PBS清洗；加ABC復合物,室溫孵育2 h，PBS沖洗5 min×3,蒸餾水沖洗3遍；加顯色液進行免疫組織化學顯色,在顯微鏡下進行觀察,待細胞著色而背底顏色較淡時馬上吸去顯色液,用蒸餾水沖3遍,加PBS終止反應；梯度酒精脫水之后,封片、拍照。②Western blot法測定COX-2及Survivin蛋白表達：組織塊用剪刀剪碎,加5倍冷提取液、150 mM NaCl、5 mM EDTA、1mM DTT、100 μg/ml PMSF、2 μg/ml Aprotinin、l% NP-40勻漿,冰浴30 min,將裂解液移至1.5 ml離心管中，1200 rpm離心5 min,取上清分裝于0.5 ml離心管中,-20℃凍存；蛋白質定量,SDS-PAGE電泳,轉膜,目的蛋白檢測。條帶的掃描數據用灰度值表示,并將同一樣本的目標蛋白和內參蛋白所獲數據進行比較得到相對表達值。

3 統計學方法 采用SPSS13.0軟件包進行統計學處理,兩組數據之間比較采用成組資料t檢驗，計數資料采用χ2檢驗,相關性用非參數Spearman等級相關檢驗分析,P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 免疫組織化學染色結果 見圖1，表1。Survivin和COX-2蛋白主要在細胞質中表達，在骨肉瘤組織(OS)和骨軟骨瘤組織(OC)中的表達分別為63.3%和73.3%、30.0%和25.0%，經檢驗差異有統計學意義(P<0.05)。

2 COX-2與Survivin蛋白表達的相關性分析 見表2。在30例骨肉瘤標本中，22例COX-2蛋白表達陽性的組織中16例Survivin蛋白表達陽性,8例COX-2陰性表達者中有3例Survivin表達陽性；COX-2陽性骨肉瘤組中,Survivin的陽性率為72.73%,顯著高于COX-2陰性組37.50%。Spearman等級相關

注：A、B 為Survivin在OS和OC中表達；C、D為COX-2在OS和OC中表達

表1 Survivin、COX-2在骨肉瘤與骨軟骨瘤中表達分析

注：與OC組比較，*P<0.05

分析表明,在骨肉瘤中Survivin和COX-2的表達呈正相關關系(r=0.775,P<0.05)。

表2 COX-2與Survivin在骨肉瘤組織中蛋白表達的相關性分析

注：兩組相關性分析，P<0.05

3 Western blot法檢測結果 見圖2。骨肉瘤組織中Survivin和COX-2蛋白表達水平顯著高于正常組織(CON組)、骨軟骨瘤組織(P<0.05)；Survivin和COX-2蛋白表達水平在正常組織、骨軟骨瘤組織及骨肉瘤組織中呈逐漸升高趨勢。

OS組與CON組及OC組相比，*P<0.05

圖2 Survivin、COX-2蛋白在骨肉瘤與骨軟骨瘤組織中表達水平

4 Survivin、COX-2蛋白表達與骨肉瘤臨床病理特征的關系 見表3。 兩者之間未見顯著相關性(P>0.05)。

表3 Survivin、COX-2蛋白表達與骨肉瘤臨床病理特征的關系分析

討 論

Survivin為細胞凋亡抑制蛋白家族成員,在凋亡的基因調控中發揮重要作用,Survivin作用機制包括抑制細胞凋亡、調節細胞增殖、誘導血管生成等[4]。Survivin廣泛表達于各種胚胎組織中，隨胚胎的發育表達逐漸減少。研究發現Survivin與惡性腫瘤的發生、發展以及腫瘤敏感性有密切聯系，已有很多關于Survivin基因與腫瘤關系的相關研究進行了深入的探索[5-6]。目前認為，Survivin引起腫瘤細胞凋亡的喪失與腫瘤的發生密切相關。本研究結果顯示，Survivin蛋白在骨肉瘤組織、骨軟骨瘤組織中都有不同程度的表達，表達的陽性率分別為63.3%和30%，而在正常組織中無表達,各組比較差異顯著。Western blot結果顯示，在骨肉瘤組織中Survivin蛋白表達的水平明顯高于骨軟骨瘤組織，在正常組織中未見表達。骨肉瘤組織、骨軟骨瘤組織及正常組織之間的Survivin表達陽性率的差異具有統計學意義。綜合以上研究結果可以看出，Survivin在骨肉瘤組織中高表達，對臨床上骨肉瘤的診斷及判斷復發具有一定的指導意義。

COX-2正常生理狀態下在大多數組織中不表達或低表達，在炎癥因子、生長因子、促癌劑等的誘導下迅速合成，參與多種病理生理過程。COX-2在惡性腫瘤中高表達，而COX-2抑制劑可抑制腫瘤細胞的增殖，促進其凋亡[7]。動物實驗證明，COX-2過表達可導致腫瘤形成，COX-2抑制劑及敲除COX-2基因的小鼠腫瘤的發生率低于對照組。由此可見，COX-2在惡性腫瘤中高表達，在腫瘤發生發展中起重要作用[8]。本研究結果顯示，COX-2蛋白在骨肉瘤組織、骨軟骨瘤組織都有不同程度的表達，表達的陽性率分別為73.3%、25%,在正常組織中也有少量表達,各組比較差異由統計學意義。Western blot結果顯示，COX-2蛋白在正常組織中表達較弱,在骨軟骨瘤組織表達增強,而在骨肉瘤組織中強表達。骨肉瘤組織、骨軟骨瘤組織及正常組織之間的Survivin表達陽性率差異顯著。由此可見，COX-2在骨肉瘤組織中高表達,推測可能在骨肉瘤的發生發展起重要作用，有望在骨肉瘤治療的治療中起重要作用。

大量研究證實，COX-2通過促進細胞增殖、抑制凋亡、誘導新生血管形成而促進腫瘤的發生、發展，而Survivin做為新的抗凋亡基因與腫瘤細胞的增殖和血管生成密切相關，二者均與骨肉瘤的發生發展比且相關。本研究通過Spearman等級相關分析表明,在骨肉瘤組織中Survivin與COX-2蛋白表達之間具正相關關系。因此聯合檢測COX-2與Survivin對骨肉瘤惡性程度的判定、預后分析以及二者聯合治療提供理論依據,但其具體機制尚不完全清楚,有待進一步深入探索。

[1] Jemal A,Bray F,Center MM,etal.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2)：69-90.

[2] Asechi H,Hatano E,Nitta T,etal.Resistance to cisplatin-induced apoptosis via PI3K-dependent survivin expression in a rat hepatoma cell line[J].Int J Oncol,2010,37(1)：89-96.

[3] Boulytcheva IV,Soloviev YN,Kushlinskii NE,etal. Expression of molecular markers in the tumor and survival prognosis in osteosarcoma[J].Bull Exp Biol Med,2010,150(2)：237-242.

[4] 談曉紅,馬 鵬.Survivin在胃粘膜癌變過程中的表達及與幽門螺桿菌感染關系探討[J].陜西醫學雜志, 2012,41(11)：1457-1459.

[5] Zhang J,Zhu Z,Sun Z,etal.Survivin gene expression increases gastric cancer cell lymphatic metastasis by upregulating vascular endothelial growth factor-C expression levels[J].Mol Med Rep,2014,9(2)：600-606.

[6] Chen Z, Liu N, Zhu G,etal. Targeting of the anti-apoptotic gene survivin in human thyroid carcinoma [J].Int J Mol Med,2012,30(3)：465-472.

[7] Huang WC,Chai CY,Chen WC,etal.Histamine regulates cyclooxygenase 2 gene activation through Orai1-mediated NFκB activation in lung cancer cells[J].Cell Calcium,2011,50(1)：27-35.

[8] Boulytcheva IV,Soloviev YN,Kushlinskii NE,etal.Expression of molecular markers in the tumor and survival prognosis in osteosarcoma[J].Bull Exp Biol Med,2010,150(2)：237-242.

(收稿：2015-03-10)

Expression of Survivin and COX-2 in human osteosarcomas and its clinical significance

Department of Orthopaedics, Shaanxi Provincial People’s Hospital(Xi’an 710068)

Duan Dapeng Qin Jing Wang Xiaoqing et al

Objective：To investigate the expression of COX-2 and survivin and clinical significance in human osteosarcomas,and explore their correlation with the pathologic characters in patients with osteosarcomas tissue.Methods：Fifty freshly resected OS and OC samples were collected at the orthopedics department of three hospitals and were classified according to American Joint Committee on Cancer TNM staging system. There were 30 cases of OS tissues and 20 cases of OC tissues. All tumors and normal tissues were diagnosed by two independent gastroenterologists.The expression of COX-2 and survivin was assessed using immunohistochemical assay and Western blot assay in biopsy samples. Results：The IHC assays shown that the expression of COX-2 and survivin was mainly localized in the cytoplasm. The expression of COX-2 and survivin was respectively observed in 73.3% and 25.0% OS tissues and in 63.3% and 30.0% OC tissues,indicating their higher expression in OS compared with OC.Spearman rank correlation analysis showed a positive correlation between COX-2 and survivin expression in OS (r=0.775,P<0.05). The relationship between the expression of COX-2 and survivin and clinicopathologic features was analyzed. No significant correlation was found between the expression of COX-2 and survivin with age and pathological grade and types of OS.Conclusion：The higher expression of COX-2 and survivin in osteosarcoma and positive correlation between COX-2 and survivin suggesting that they may be provide a potential therapeutic strategy for the treatment in osteosarcoma.

Osteosarcoma Chondrosarcoma Cyclooxygenase 2 @Survivin

*陜西省社會發展科技攻關項目(2015SF051)

骨肉瘤 軟骨肉瘤 環氧合酶2 @Survivin

R738.1

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.10.003

▲通訊作者