糖皮質(zhì)激素激活自噬對軟骨細(xì)胞衰老的影響*

薛恩興，張　雪，陳成旺，張　宇(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，手術(shù)室，浙江溫州35000)

糖皮質(zhì)激素激活自噬對軟骨細(xì)胞衰老的影響*

薛恩興1△，張雪2，陳成旺1，張宇1
(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院1關(guān)節(jié)外科，2手術(shù)室，浙江溫州325000)

目的:探討糖皮質(zhì)激素對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞衰老和自噬影響，并分析自噬在其中的作用及機(jī)制。方法:培養(yǎng)SD大鼠軟骨細(xì)胞，阿利辛染色和collagen II免疫組化進(jìn)行鑒定。使用不同濃度的地塞米松作用于軟骨細(xì)胞不同的時(shí)間后，LysoTracker Red和MDC染色觀察自噬囊泡的生成，Western blot檢測LC3、beclin-1、P62、p70S6K 和4EBP1蛋白表達(dá)的變化。β-半乳糖苷酶染色分析糖皮質(zhì)激素對軟骨細(xì)胞衰老的影響，并使用自噬抑制劑來探討自噬對地塞米松作用下軟骨細(xì)胞衰老的作用。結(jié)果:地塞米松可以顯著提高軟骨細(xì)胞的自噬水平，尤其是在作用4 d后，LC3-II表達(dá)隨著地塞米松濃度的增加而升高，而P62和beclin-1的表達(dá)也驗(yàn)證自噬水平的升高。LysoTracker Red和MDC染色發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞中自噬泡的生成隨著地塞米松濃度的升高而增加。mTOR信號通路上的p70S6K和4EBP1的磷酸化均被地塞米松抑制。更重要的是，地塞米松可以引起軟骨細(xì)胞的衰老，而使用3-MA抑制自噬后，細(xì)胞進(jìn)一步衰老。結(jié)論:糖皮質(zhì)激素激活軟骨細(xì)胞中的自噬，并同時(shí)誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的衰老，而自噬在這過程中對細(xì)胞的衰老可能具有代償性的保護(hù)作用。同時(shí)糖皮質(zhì)激素抑制mTOR信號通路，可能與自噬的激活相關(guān)。

糖皮質(zhì)激素;軟骨細(xì)胞;自噬;衰老

［ABSTRACT］AIM: To explore the effect of glucocorticoid on autophagy and senescence in the chondrocytes.METHODS: The collagen II in the normal chondrocytes isolated from the SD rats was checked.After stimulation with glucocorticoid，LysoTracker Red staining，MDC staining and Western blot were used to detect the level of autophagy in the chondrocytes.The mTOR pathway related molecules were investigated by Western blot.Cell senescence was analyzed by SA-β-gal staining.RESULTS: A dose-dependent increase in the number of autophagic vacuoles was observed in the dexamethasone-treated chondrocytes，which was demonstrated by the LysoTracker Red and MDC staining.The expression of LC3-II and beclin-1 was increased by dexamethasone，especially in the cells treated with dexamethasone for 4 d.However，P62 expression was decreased.SA-β-gal staining showed that the percentage of cell senescence was increased by dexamethasone.Surprisingly，the cell senescence induced by dexamethasone was exacerbated by the autophagic inhibitor 3-MA.CONCLUSION: Autophagy induced by dexamethasone protects chondrocyte from senescence.The mTOR pathway may be involved in the autophagy activation.

［KEY WORDS］Glucocorticoids; Chondrocyte; Autophagy; Senescence

骨關(guān)節(jié)炎是骨科常見的疾病，在美國25歲以上人群的骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病率約14%，每年近40萬骨性關(guān)節(jié)炎患者住院［1］。臨床上，局部關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射糖皮質(zhì)激素可以明顯緩解骨關(guān)節(jié)炎，具有顯著的抗炎、止痛和減輕膝關(guān)節(jié)功能障礙的作用，但是長期、反復(fù)注射糖皮質(zhì)激素又會(huì)干擾軟骨細(xì)胞代謝，加速軟骨細(xì)胞凋亡壞死，最終加重骨關(guān)節(jié)炎病情。骨關(guān)節(jié)炎是與年齡密切相關(guān)的疾病，細(xì)胞衰老是關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的重要參與因素，然而糖皮質(zhì)激素對軟骨細(xì)胞衰老的影響尚缺乏研究。

自噬被認(rèn)為是軟骨細(xì)胞的自我保護(hù)機(jī)制，且外源性激發(fā)自噬亦可以保護(hù)軟骨細(xì)胞和關(guān)節(jié)軟骨［2-3］，但是糖皮質(zhì)激素對軟骨細(xì)胞自噬水平的調(diào)節(jié)作用，以及自噬對細(xì)胞衰老的具體作用仍然未知。本文擬使用地塞米松(dexamethasone，DEX)作用軟骨細(xì)胞，并檢測自噬與衰老指標(biāo)以了解糖皮質(zhì)激素對軟骨細(xì)胞衰老和自噬的影響，以及自噬在其中所扮演的作用。

材料和方法

1實(shí)驗(yàn)試劑與材料

地塞米松、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)、胎牛血清和青/鏈雙抗購自Sigma; DMEM-F12培養(yǎng)基、0. 25%胰蛋白酶、II型膠原酶和MDC熒光染料均購自Gibco;細(xì)胞裂解液、PMSF、SDS上樣緩沖液、總蛋白提取和BCA蛋白分析試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PVDF膜和Lyso-Tracker Red試劑盒均購自江蘇碧云天公司;兔抗鼠多克隆抗體、II型膠原、LC3、beclin-1、P62、p-p70S6K、p70S6K、p-4EBP1、4EBP1、β-actin購自CST;細(xì)胞培養(yǎng)瓶和多孔板購自Corning。

2關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)和處理

30只雄性SD大鼠(3月齡，250～300 g)，使用10%水合氯醛(3. 5 mL/kg)麻醉后安樂死。整體取出膝關(guān)節(jié)，在顯微鏡下分離膝關(guān)節(jié)軟骨組織。首先使用0. 25%胰酶消化30 min，再使用0. 1% II型膠原酶在37℃消化軟骨組織4 h，再使用200目的濾網(wǎng)過濾細(xì)胞。軟骨細(xì)胞培養(yǎng)在25 cm2的培養(yǎng)瓶中，使用含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的高糖DMEM(1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素) 在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合到80%～90%的時(shí)候，使用0. 25%的含EDTA的胰酶進(jìn)行消化傳代。本實(shí)驗(yàn)所有的細(xì)胞均為軟骨細(xì)胞第2代。

在DEX處理之前，用1% FBS培養(yǎng)基處理12 h，按地塞米松濃度分為5組: 0 mg/L、0. 1 mg/L、1 mg/ L、25 mg/L、50 mg/L組，作用時(shí)間分別為2 d、4 d和6 d。3-MA與地塞米松混合分為4組:正常對照(control)組、3-MA(10 mmol/L)組、3-MA + DEX(25 mg/L)組和DEX。因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)所涉及的地塞米松是使用培養(yǎng)基和無水乙醇進(jìn)行配置，以上對照組中，均加入1 mL/L的無水乙醇作為對照。

3實(shí)驗(yàn)方法

3.1LysoTracker Red染色細(xì)胞以2×105的密度鋪在24孔板上，以上述不同濃度的地塞米松處理細(xì)胞4 d后。使用新鮮的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3遍，使用培養(yǎng)基將LysoTracker Red稀釋成66 mmol/L，滴加1 mL后，在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。使用PBS洗滌3遍后，在倒置熒光顯微鏡下使用綠色濾光片觀察細(xì)胞的染色情況。

3.2MDC染色在體外研究中，MDC是被廣泛地用來標(biāo)記細(xì)胞中自噬囊泡的水平。與LysoTracker Red染色相似，處理關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞后使用PBS清洗3遍后，在不固定軟骨細(xì)胞的情況下，使用0. 05 mmol/L MDC在37℃培養(yǎng)箱孵育30 min。PBS洗滌細(xì)胞3次，直接在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，使用紫外激發(fā)光。為了觀察細(xì)胞的自噬率，上述染色后的細(xì)胞再上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

3.3Western blot將處理過的細(xì)胞用PBS洗滌，常規(guī)裂解提取蛋白，使用BCA試劑盒測算總蛋白濃度并制成蛋白樣品。上樣量為30 μg，總體積是20 μL，使用12%的分離膠分離蛋白后，將LC3目的蛋白轉(zhuǎn)至0. 22 μm大小的PVDF膜上，而beclin-1、p62和內(nèi)參照則轉(zhuǎn)至0. 45 μm的膜上。300 mA恒流轉(zhuǎn)膜，LC3轉(zhuǎn)移20 min，beclin-1轉(zhuǎn)移55 min，而P62轉(zhuǎn)移90 min。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。TBST洗滌3次，每次5 min。LC3、beclin-1和p62的I抗均1∶1 000稀釋。膜洗凈后放在I抗中，4℃搖床孵育過夜。再次使用TBST洗滌3次，取出膜后放置在II抗中，II抗使用5%脫脂奶粉稀釋(1∶5 000)，37℃室溫2 h。取出膜后再使用上述方法洗滌。預(yù)先將ECL試劑A液、B液等體積混合，制成反應(yīng)液后，滴加至PVDF膜上，使液體覆蓋到整張膜。將滴加了發(fā)光液的膜轉(zhuǎn)移至化學(xué)發(fā)光顯像儀。

3.4β-半乳糖苷酶染色25 mg/L的地塞米松處理軟骨細(xì)胞24 h、48 h和72 h，使用試劑盒中β-半乳糖苷酶的固定液在室溫下固定15 min。PBS清洗3遍，使用β-半乳糖苷酶染液染色12 h，β-半乳糖苷酶染液含有1 g/L 5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷、5 mmol/L亞鐵氰化鉀、5 mol/L鐵氰化鉀、150 mmol/L氯化鈉和2 mmol/L氯化鎂。染色后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，在200倍的放大情況下觀察陽性細(xì)胞在總細(xì)胞中的百分比。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

全部數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 16. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間差異比較采用單因素方差分析，兩兩之間比較用Turkey’s方法進(jìn)行檢測，以P＜0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1軟骨細(xì)胞的鑒定

在相差顯微鏡下觀察，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞呈現(xiàn)多邊形和星形，且細(xì)胞胞質(zhì)中含有豐富的顆粒。甲苯胺藍(lán)和阿利辛染色分別將細(xì)胞染成紫色和淺藍(lán)色，這說明細(xì)胞中含有豐富的蛋白多糖，II膠原的免疫組化表明細(xì)胞中含有大量的II型膠原，并主要分布在細(xì)胞核周圍，上述結(jié)果證明該細(xì)胞為能分泌蛋白多糖和II型膠原的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，見圖1。

Figure 1.The culture and identification of nucleus pulposus cells.A: the observation of the cells under phasecontrast microscopy; B: Toluidine blue staining; C: Alcian blue staining; D: immunochemistry for collagen II.圖1　軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定

2糖皮質(zhì)激素促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中自噬泡合成

為了解糖皮質(zhì)激素是否可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞發(fā)生自噬，我們使用不同濃度的地塞米松作用軟骨細(xì)胞4 d，并使用LysoTracker Red染色和MDC染色觀察軟骨細(xì)胞中的自噬泡。對照情況下，僅有少量的軟骨細(xì)胞LysoTracker Red染色呈現(xiàn)陽性，但是隨著地塞米松濃度的增大，呈LysoTracker Red染色陽性的細(xì)胞越來越多。在50 mg/L的地塞米松作用4 d后，大部分的軟骨細(xì)胞的LysoTracker Red的染色呈陽性，說明地塞米松可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞自噬泡的合成，見圖2。

與LysoTracker Red染色相似，在正常對照組，只有少數(shù)細(xì)胞可以吸收MDC染色，因此只有少量細(xì)胞含有高亮的點(diǎn)狀熒光，但是隨著地塞米松濃度的增加，含有高亮點(diǎn)狀自噬泡的軟骨細(xì)胞逐漸增多。將MDC染色后的軟骨細(xì)胞使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，1 mg/L、25 mg/L和50 mg/L的地塞米松作用4 d后，自噬的發(fā)生率與對照組相比明顯升高(P＜0. 05)。在50 mg/L組，自噬的發(fā)生率平均為56. 74%，見圖3。

Figure 2.The LysoTracker Red staining of chondrocytes treated with dexamethasone at different concentrations.An dose-dependent increase in the intensity of LysoTracker Red staining in chondrocytes stimulated with dexamethasone was found.圖2　軟骨細(xì)胞的LysoTracker Red染色

Figure 3.The MDC staining and flow cytometry analysis of chondrocytes treated with dexamethasone.Mean±SD.n =3.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs 0 mg/L.圖3　軟骨細(xì)胞的MDC染色和流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

3糖皮質(zhì)激素上調(diào)自噬相關(guān)蛋白

為了進(jìn)一步分析糖皮質(zhì)激素對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用，我們使用Western blot法分析地塞米松作用軟骨細(xì)胞后LC3、beclin-1和p62的表達(dá)水平。當(dāng)?shù)厝姿勺饔密浌羌?xì)胞2 d后，不同組之間的LC3-II/β-actin的區(qū)別并不明顯;但是在作用4 d后，LC3-II/β-actin的水平隨著地塞米松劑量的增加明顯升高;而在作用6 d后，高濃度(50 mg/L)地塞米松組的LC3-II/β-actin水平出現(xiàn)了一定的下降。而p62 和beclin-1表達(dá)的變化基本與LC3-II的變化一致，但p62在作用2 d的時(shí)候就已經(jīng)隨著地塞米松濃度的增加而逐漸的下降，見圖4。

4糖皮質(zhì)激素抑制mTOR信號通路

自噬的激活機(jī)制主要涉及到mTOR依賴和非mTOR依賴的信號通路，p70S6K和4EBP1是mTOR下游的信號分子。1 mg/L和25 mg/L的地塞米松作用后，p-p70S6K和p-4EBP1的表達(dá)水平相對于對照組明顯降低，這說明在糖皮質(zhì)激素的作用下，mTOR信號通路被抑制，見圖5。

5糖皮質(zhì)激素及自噬對軟骨細(xì)胞衰老的作用

隨著25 mg/L的糖皮質(zhì)激素作用時(shí)間的延長，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的β-半乳糖苷酶陽性率明顯升高，作用72 h后最高。由于細(xì)胞的衰老，β-半乳糖苷酶陽性的細(xì)胞胞漿中染成藍(lán)色。但是使用3-MA與地塞米松共同作用軟骨細(xì)胞72 h，3-MA抑制自噬水平后，軟骨細(xì)胞中β-半乳糖苷酶的陽性率相對于單純糖皮質(zhì)激素的明顯升高，并且單純的3-MA并沒有引起陽性細(xì)胞的增多，見圖6。

討論

在本研究中，我們證實(shí)了糖皮質(zhì)激素可以通過抑制mTOR信號通路激活關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的自噬，同時(shí)糖皮質(zhì)激素可以引起軟骨細(xì)胞的衰老，而自噬對于糖皮質(zhì)激素作用下的細(xì)胞的衰老具有一定的抑制作用，抑制自噬后，細(xì)胞的衰老反而加劇。

糖皮質(zhì)激素被廣泛地用于治療骨關(guān)節(jié)炎引起的各種癥狀，但是長期、反復(fù)的使用往往帶來各種不同的并發(fā)癥［4-5］，更重要的是糖皮質(zhì)激素會(huì)引起軟骨細(xì)胞的凋亡，阻止軟骨細(xì)胞的生長和降低軟骨細(xì)胞的活性［5-6］。軟骨細(xì)胞凋亡會(huì)引起軟骨中細(xì)胞數(shù)量的減少，并減少細(xì)胞外基質(zhì)如蛋白多糖和II型膠原的合成的減少，因此軟骨細(xì)胞的凋亡是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的重要因素［7-8］。而自噬與凋亡相似，亦是程序性細(xì)胞死亡，雖然有研究報(bào)道糖皮質(zhì)激素可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞自噬［9］，但是其具體作為以及激活機(jī)制尚不明確。

Figure 4.The expression of autophagy-related protein in chondrocytes treated with dexamethasone (DEX).Mean±SD.n =3.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs 0 mg/L.圖4　軟骨細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

自噬不僅與細(xì)胞的凋亡有密切關(guān)系，而且有減輕骨關(guān)節(jié)炎的作用［3］。自噬是細(xì)胞清除細(xì)胞中錯(cuò)構(gòu)蛋白質(zhì)和失去功能的細(xì)胞及大分子的一種必要的細(xì)胞維持自身穩(wěn)態(tài)平衡的機(jī)制［10］。當(dāng)細(xì)胞受到外界環(huán)境的刺激、處于應(yīng)激狀態(tài)或者是受到細(xì)菌的侵襲的時(shí)候，大多數(shù)哺乳動(dòng)物的細(xì)胞質(zhì)中會(huì)產(chǎn)生雙層膜的結(jié)構(gòu)，成為自噬體，自噬體將細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器包繞起來，溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，從而利用溶酶體中的酶將這些細(xì)胞器和蛋白質(zhì)進(jìn)行降解，為細(xì)胞提供能量和氨基酸，從而保護(hù)細(xì)胞［11］。在體外，軟骨細(xì)胞中的自噬可以抑制細(xì)胞的凋亡，并且可以阻止IL-1β引起的細(xì)胞外基質(zhì)的降解［12］，而在體內(nèi)研究中，不論是腹腔注射雷帕霉素還是關(guān)節(jié)腔內(nèi)局部注射雷帕霉素來促進(jìn)軟骨細(xì)胞中的自噬水平，均可以緩解關(guān)節(jié)軟骨退變的進(jìn)展［2］。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)地塞米松可以顯著地促進(jìn)軟骨細(xì)胞中的自噬水平，我們推測這可能是軟骨細(xì)胞對地塞米松應(yīng)激的一種代償性作用。

激活自噬關(guān)鍵的“開關(guān)”往往是在mTOR復(fù)合物1中的mTOR分子，根據(jù)這一現(xiàn)象，自噬激活的通路也主要分為mTOR依賴性和mTOR非依賴性［13］。抑制mTOR后可以引起細(xì)胞中自噬的一系列過程。mTOR下游的信號分子主要為p70S6K和4EBP1。我們發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素可以顯著抑制軟骨細(xì)胞中p70S6K和4EBP1磷酸化水平，說明糖皮質(zhì)激素激活軟骨細(xì)胞中的自噬與其抑制mTOR信號通路有關(guān)。相似的是，治療關(guān)節(jié)軟骨的葡萄糖氨也是通過抑制mTOR信號通路激活自噬的［14］。這說明軟骨細(xì)胞中mTOR信號通路可能是自噬激活的主要信號通路。

糖皮質(zhì)激素可以引起多種細(xì)胞的生長阻滯并抑制細(xì)胞的活性，Poulsen等［15］發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素可以引起肌腱細(xì)胞的生長周期阻滯，并誘發(fā)細(xì)胞衰老，但是糖皮質(zhì)激素是否可以引起軟骨細(xì)胞的衰老目前仍然未見報(bào)道。當(dāng)細(xì)胞生長發(fā)生停滯的時(shí)候，其既可以是靜止?fàn)顟B(tài)也可以是細(xì)胞發(fā)生衰老。細(xì)胞發(fā)生衰老的時(shí)候，細(xì)胞擴(kuò)增能力喪失但是細(xì)胞的體積仍然增大，導(dǎo)致衰老的細(xì)胞相對正常細(xì)胞更加肥大［16］。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)地塞米松也可以促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的衰老，并且隨著時(shí)間的延長作用更加明顯。因?yàn)檐浌羌?xì)胞的衰老參與了骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展，因此長期使用糖皮質(zhì)激素引起的軟骨細(xì)胞的衰老可能是其引起關(guān)節(jié)軟骨變性、壞死的作用機(jī)制之一。

自噬與細(xì)胞的衰老密切相關(guān)，但是目前關(guān)于兩者之間的關(guān)系尚未有統(tǒng)一的意見。Kamalakannan等［17］發(fā)現(xiàn)自噬可以阻止熱休克蛋白引起的單核細(xì)胞衰老，但是在肺支氣管上皮細(xì)胞中，自噬又介導(dǎo)了氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞衰老。而在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中，我們使用3-MA抑制自噬水平發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的衰老反而進(jìn)一步加重，這說明糖皮質(zhì)激素作用下細(xì)胞自噬可能是代償性延緩細(xì)胞衰老。

總之，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素不僅可以通過抑制mTOR信號通路激活軟骨細(xì)胞自噬，而且會(huì)誘發(fā)細(xì)胞衰老，并且自噬具有延緩細(xì)胞衰老作用，這或許為臨床上防治糖皮質(zhì)激素的并發(fā)癥提供新的思路。

Figure 5.The protein levels of mTOR pathway molecules in the chondrocytes treated with dexamethasone (DEX).Mean±SD.n =3.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs 0 mg/L.圖5　糖皮質(zhì)激素對軟骨細(xì)胞mTOR信號通路的作用

Figure 6.β-galactosidase (β-Gal) staining of chondrocytes treated with glucocorticoids and/or 3-MA.Mean±SD.n =3.△△P＜0. 01 vs control;＊＊P＜0. 01 vs DEX.圖6　軟骨細(xì)胞的β-半乳糖苷酶染色

［1］Hunter DJ，Altman RD，Cicuttini F，et al.OARSI clinical trials recommendations: knee imaging in clinical trials in osteoarthritis［J］.Osteoarthritis Cartilage，2015，23 (5) : 698-715.

［2］Takayama K，Kawakami Y，Kobayashi M，et al.Local intra-articular injection of rapamycin delays articular cartilage degeneration in a murine model of osteoarthritis［J］.Arthritis Res Ther，2014，16(6) : 482.

［3］López de Figueroa P，Lotz MK，Blanco FJ，et al.Autophagy activation and protection from mitochondrial dysfunction in human chondrocytes［J］.Arthritis Rheumatol，2015，67(4) : 966-976.

［4］Tu Y，Xue H，F(xiàn)rancis W，et al.Lactoferrin inhibits dexamethasone-induced chondrocyte impairment from osteoarthritic cartilage through up-regulation of extracellular signal-regulated kinase 1/2 and suppression of FASL，F(xiàn)AS，and Caspase 3［J］.Biochem Biophys Res Commun，2013，441(1) : 249-255.

［5］Zaman F，Chrysis D，Huntjens K，et al.Dexamethasone differentially regulates Bcl-2 family proteins in human proliferative chondrocytes: role of pro-apoptotic Bid［J］.Toxicol Lett，2014，224(2) : 196-200.

［6］Hong D，Chen HX，Yu HQ，et al.Quantitative proteomic analysis of dexamethasone-induced effects on osteoblast differentiation，proliferation，and apoptosis in MC3T3-E1 cells using SILAC［J］.Osteoporos Int，2011，22 (7) : 2175-2186.

［7］Aigner T，Hemmel M，Neureiter D，et al.Apoptotic cell death is not a widespread phenomenon in normal aging and osteoarthritis human articular knee cartilage: a study of proliferation，programmed cell death (apoptosis)，and viability of chondrocytes in normal and osteoarthritic human knee cartilage［J］.Arthritis Rheum，2001，44(6) : 1304-1312.

［8］葉志強(qiáng)，張榮凱，陳郁鮮，等.Egr-1介導(dǎo)了IL-1β誘導(dǎo)的小鼠軟骨細(xì)胞凋亡［J］.中國病理生理雜志，2012，28(8) : 1482-1487.

［9］Zhao Y，Zuo Y，Huo HJ，et al.Glucocorticoid induced autophagy in N1511 chondrocyte cells［J］.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2014，18(23) : 3573-3579.

［10］Wu X，Won H，Rubinsztein DC.Autophagy and mammalian development［J］.Biochem Soc Trans，2013，41(6) : 1489-1494.

［11］Levine B，Kroemer G.Autophagy in the pathogenesis of disease［J］.Cell，2008，132(1) : 27-42.

［12］Sasaki H，Takayama K，Matsushita T，et al.Autophagy modulates osteoarthritis-related gene expressions in human chondrocytes［J］.Arthritis Rheum，2011，64(6) : 1920-1928.

［13］Alayev A，Holz MK.mTOR signaling for biological control and cancer［J］.J Cell Physiol，2013，228 (8) : 1658-1664.

［14］Carames B，Kiosses WB，Akasaki Y，et al.Glucosamine activates autophagy in vitro and in vivo［J］.Arthritis Rheum，2013，65(7) : 1843-1852.

［15］Poulsen RC，Watts AC，Murphy RJ，et al.Glucocorticoids induce senescence in primary human tenocytes by inhibition of sirtuin 1 and activation of the p53/p21 pathway: in vivo and in vitro evidence［J］.Ann Rheum Dis，2014，73(7) : 1405-1413.

［16］Muller M.Cellular senescence: molecular mechanisms，in vivo significance，and redox considerations［J］.Antioxid Redox Signal，2009，11(1) : 59-98.

［17］Kamalakannan V，Shiny A，Babu S，et al.Autophagy protects monocytes from wolbachia heat shock protein 60-induced apoptosis and senescence［J］.PLoS Negl Trop Dis，2015，9(4) : e0003675.

(責(zé)任編輯:陳妙玲，余小慧)

Effect of glucocorticoid induced autophagy on senescence in chondrocytes

XUE En-xing1，ZHANG Xue2，CHEN Cheng-wang1，ZHANG Yu1
(1Department of Joint Surgery，2Operating Room，Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China.E-mail: xueenxing@163.com)

R363; R339. 3+8

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.10.002

1000-4718(2015)10-1737-07

2015-04-20

2015-06-05

溫州市科技局項(xiàng)目(No.Y20140582)

△Tel: 0577-88002808; E-mail: xueenxing@163.com