尼克酰胺對人臍帶間充質干細胞的保護效應*

楊曉蕾，陳智聰，廖繼東△，谷景義，于　波，劉革修(暨南大學醫學院田家炳醫學實驗中心，血液病研究所，廣東廣州5063)

尼克酰胺對人臍帶間充質干細胞的保護效應*

楊曉蕾1，陳智聰1，廖繼東1△，谷景義1，于波1，劉革修2
(暨南大學醫學院1田家炳醫學實驗中心，2血液病研究所，廣東廣州510632)

目的:探討尼克酰胺(nicotinic acid amide，NAA)減輕人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)輸注損傷的效應。方法:空白對照組為0. 3 mL生理鹽水、MSC組為0. 3 mL 1× 106CFSE標記的hUC-MSCs，MSC + NAA組為0. 3 mL 10 mmol/L NAA處理24 h的1×106CFSE標記的hUC-MSCs，分別與2. 7 mL正常人全血混勻，注入改良Chandler Loop內，在37℃下，20 mL/min循環1 h，檢測循環前后血小板、白細胞、hUC-MSCs和C3a的變化。結果:血小板消耗率空白對照組為(29. 96±10. 88) %、MSC組為(77. 76± 19. 29) %、MSC + NAA組為(50. 13±18. 10) %;白細胞消耗率空白對照組為(37. 82±13. 81) %、MSC組為(64. 57 ±17. 08) %、MSC + NAA組為(41.52±17.26) %，MSC組和MSC + NAA組與空白對照組比較差異均有統計學意義(P＜0. 05)。MSC + NAA組的hUC-MSCs存活率較MSC組高(P＜0. 05)。空白對照、MSC和MSC + NAA組的C3a含量分別為(206. 27±58. 10)μg/L、(230. 47±39. 61)μg/L和(208. 37±40. 66)μg/L。結論: hUC-MSCs與正常人全血在改良Chandler Loop內共循環1 h可模擬血液介導即刻炎癥反應(instant blood-mediated inflammatory reaction，IBMIR)，大量損耗MSCs和血液成分，導致C3a上升。NAA可抑制IBMIR、降低血液成分的損耗、提高hUC-MSCs的存活率，提示NAA能減輕MSCs的輸注損傷。

人臍帶間充質干細胞;血液介導即刻炎癥反應; Chandler Loop;尼克酰胺

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effect of nicotinic acid amide (NAA) on the infusion damage of human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) under the condition of instant blood-mediated inflammatory reaction (IBMIR).METHODS: Normal peripheral blood without anticoagulant at volume of 2. 7 mL was mixed with 0. 3 mL physiological saline (as blank group)，CFSE labeled hUC-MSCs (1×106cells in 0. 3 mL as MSC group) and CFSE labeled hUC-MSCs (1×106cells in 0. 3 mL) preprocessed with NAA at concentration of 10 mmol/L for 24 h (as MSC + NAA group)，respectively.The mixture was immediately injected into the improved Chandler Loop model，placed in 37℃water bath，and then started the peristaltic pump at the speed of 20 mL/min for 1 h.The number of CFSE labeled hUC-MSCs，platelets，white blood cells were counted and the concentration of complement C3a was measured before and after cycling，respectively.RESULTS: After 1 h circulation，the platelet dissipation rate were (29. 96±10. 88) % in blank group，(77. 76±19. 29) % in MSC group all and (50. 13±18. 10) % in MSC + NAA group; and the leukocyte counts were (37. 82±13. 81) % in blank group，(64. 57±17. 08) % in MSC group and (41. 52±17. 26) % in MSC + NAA group.Compared with blank group，the differences of the dissipation rates in MSC group and MSC + NAA group all had statistical significance.The hUC-MSCs relative survival rate in MSC + NAA group was higher than that in MSC group.C3a concentrations in blank group，MSC group and MSC + NAA group were (206. 27±58. 10)，(230. 47±39. 61) and (208. 37± 40. 66)μg/L，respectively.CONCLUSION: Co-circulating the mixture of hUC-MSCs with normal peripheral blood without anticoagulant in the improved Chandler Loop for 1 h depletes a large number of hUC-MSCs and blood components，and increases C3a，suggesting that this model can induce IBMIR.NAA has a protective effect on the hUC-MSCs in the infusion damage by inhibiting IBMIR，reducing the wastage of the blood components and enhancing the survival rate of the hUCMSCs.

［KEY WORDS］hUC-MSCs; Instant blood-mediated inflammatory reaction; Chandler Loop; Nicotinic acid amide

細胞治療是利用患者自體(或異體)的細胞對組織、器官進行修復，已被用于白血病、癌癥或腫瘤、免疫系統疾病、神經系統疾病等多種疾病的臨床治療研究，展現出誘人的應用前景［1］。隨著細胞生物學，尤其是干細胞研究的深入發展和細胞工程技術的不斷進步，可用于細胞治療的細胞來源日益豐富，靶標不斷拓展［2］。細胞治療無論是細胞代替治療，刺激治療還是養生療法，都必須將細胞導入機體內部的靶標部位。迄今，將各類細胞導入機體的最佳途徑仍然是通過血循環系統。因此，治療細胞進入機體首先接觸的就是血液。報道證實，治療細胞一旦接觸患者的血液便可發生血液介導即刻炎癥反應(instant blood-mediatedinflammatoryreaction，IBMIR)［3-4］，使高達70%的輸入細胞被快速破壞而丟失［5-7］。這是影響細胞治療療效、導致彌漫性血管內凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)及免疫反應的主要原因之一。間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)因其來源廣、分化增殖潛力大、免疫原性低而獲得廣泛關注，已被用于多項臨床疾病的細胞治療實驗研究。已有報道證實MSC與受體血液接觸所致IBMIR可能與其療效低下有直接關系［8］。可見抑制MSC輸注所致IBMIR是減少不良反應、提高療效的潛在途徑之一。本文利用改良的Chandler Loop模擬體內IBMIR，探討尼克酰胺(nicotinic acid amide，NAA)減輕人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord MSCs，hUC-MSCs)輸注損傷的保護效應及其機制。

材料和方法

1材料

本實驗采用在暨南大學華僑醫院婦產科出生的、胎齡為37～40周、無先天性疾病及梅毒、艾滋病、肝炎等傳染性疾病的健康新生兒臍帶，按本室已有程序制備鑒定hUC-MSCs［9-10］。供者對臍帶用于實驗研究均已知情同意，并獲暨南大學華僑醫院醫學倫理委員會批準。正常人外周血取自健康自愿者(臨用前采集) ; NAA購自Sigma;人補體C3a酶聯免疫分析試劑盒購自廣州穗碩生物有限公司。

2方法

2.1hUC-MSCs的處理和標記取0. 984 g NAA用1 L雙蒸水溶解成80 mmol/L濃度的NAA溶液。將傳代3～5 d、生長狀態良好的hUC-MSCs用0. 25%胰蛋白酶消化1 min，1 000 r/min離心5 min收集細胞，PBS洗3次后用37℃預溫的無血清DMEM/F12

配成1×1010/L，加入等體積NAA溶液(終濃度為10 mmol/L)，置37℃培養箱中孵育24 h，1 000 r/min離心5 min收集細胞，PBS洗3次后調整細胞濃度至1×1010/L。取500 μg CFSE溶解于180 μL DMSO (20 g/L)配成5 mmol/L溶液儲存于－20℃備用。每1 mL細胞懸液加入CFSE溶液0.8 μL，置37℃10 min，轉移至4℃冰浴，加入800 μL PBS，終止反應10 min，1 000 r/min離心5 min收集細胞，PBS洗2次，用PBS調整細胞至1×109/L。

2.2改良的Chandler Loop模型構建根據Chandler Loop模型［3，11-12］，結合實驗目的進行改良，改良模型擬申報專利，暫時保密。

2.3IBMIR實驗按表1所示，各取含1×106經0、10 mmol/L NAA預處理的、經CFSE標記的hUCMSCs細胞懸液及生理鹽水300 μL與2. 7 mL新鮮正常人外周血混勻(終濃度為1×105hUC-MSCs)，迅速注入改良Chandler Loop模型的環管內，以20 mL/ min的流速循環1 h。分別取1 mL用于hUC-MSCs檢測和20 μL用于血細胞計數，其余血樣經3 000 r/ min離心15 min分離血漿用于人C3a檢測。

表1　IBMIR實驗分組及實驗方案Table 1.Grouping and protocol of the IBMIR experiment (n =7)

2.4白細胞、血小板計數和白細胞分類計數取血樣20 μL分別加入380 μL白細胞或血小板稀釋液(南京建成科技有限公司出品)中混勻，顯微鏡下通過血細胞計數板分別用低倍鏡和高倍鏡計數血小板和白細胞總數。另取一滴血樣涂片，經快速瑞姬氏染色液染色，在油鏡下進行白細胞分類計數。以上操作均由2位以上熟練人員在互不干擾的情況下分別獨立進行計數和分類，取其計數的平均值［13］。

2.5hUC-MSCs的檢測分別取NAA處理和未處理的CFSE標記的hUC-MSCs細胞懸液及PBS液100 μL與EDTA抗凝的正常人外周血900 μL混勻作為相應各組的參照(未經改良Chandler Loop模型循環)。向各實驗樣本及其參照中加入14 mL PBS混勻，4℃1 000 r/min離心10 min。吸去上層細胞碎片，沉淀細胞加PBS至1 mL，吹打混勻，取200 μL加入96孔螢光酶標板內，重復3孔。在TZ-CANSAFIRE-2螢光酶標儀(TZCAN)上，以490 nm激發，檢測530 nm熒光度值，按下列公式計算hUC-MSCs的相對存活率。

2.6C3a的檢測取3 mL新鮮正常人外周血配制空白血清對照(Serum)組。按試劑盒操作指南，在96孔板上設置標準曲線及空白孔，分別加入不同濃度標準溶液50 μL及等體積樣本稀釋液，其余各孔分別加入樣品稀釋液40 μL、樣品10 μL，輕搖混勻，蓋上蓋板，置于濕盒內37℃溫育30 min;除空白孔外每孔加入酶標試劑50 μL，繼續溫育30 min;棄去液體并甩干，加滿洗滌液靜置30 s棄去，如此重復5次，拍干;加顯色劑A 50 μL，混勻37℃避光顯色15 min;加終止液50 μL，立即在TZ-CAN-SAFIRE-2螢光酶標儀上讀取450 nm波長吸光度(A)值。以標準孔的濃度與A值計算標準曲線的直線回歸方程，將樣品A值代入方程并乘以稀釋倍數計算樣品實際濃度。

3統計學處理

實驗數據用均值±標準差(mean±SD)表示，應用SPSS 13. 0統計軟件進行分析，用單因素方差分析和t檢驗檢測組間均數差異，以P＜0. 05為差異有統計學意義。

結果

1NAA降低血液成分損耗率

經改良的Chandler Loop模型循環1 h后，各組血液成分的損耗情況見表2。可見加入1×106hUCMSCs(MSC組和MSC + NAA組)后血小板、粒細胞、淋巴細胞及單核細胞的損耗率(%)與空白對照組相比明顯增加(P＜0. 05)。經10 mmol/L NAA處理的hUC-MSCs較未經NAA處理的hUC-MSCs相比，血小板、粒細胞、淋巴細胞及單核細胞的損耗率明顯下降(P＜0. 05)。

表2　血液成分損耗率Table 2.The dissipation rate of the blood components (%.Mean±SD.n =7)

2NAA提高hUC-MSCs存活率

CFSE標記的hUC-MSCs的熒光檢測計算結果見圖1所示。可見，經10 mmol/L NAA處理較未經NAA處理的hUC-MSCs存活率高(P＜0. 05)。

Figure 1.The survival rate of hUC-MSCs.Mean±SD.n = 7.*P＜0. 05 vs MSC.圖1　hUC-MSCs的存活率

3NAA未能抑制使血清C3a上升

經改良的Chandler Loop裝置循環1 h后，各組血清經ELISA檢測C3a的含量見圖2所示。可見實驗組(MSC組和MSC + NAA組)和空白對照組的C3a含量均明顯高于空白血清對照組，差異顯著(P＜0. 05)。

Figure 2.The changes of serum C3a contents.Mean±SD.n = 7.*P＜0. 05 vs serum.圖2　血清C3a含量的變化

4 hUC-MSCs的鑒定

本實驗制備的傳代培養第3代hUC-MSCs呈均一的梭形成纖維細胞樣聚集貼壁生長，表達CD105+/CD29+/CD44+/CD31－/CD34－/CD40－/CD45－/ HLA-DR－，可分化為成骨細胞及脂肪細胞，見圖3、4。

Figure 3.Morphology of human umbilical cord mesenchymal stem cells at passage 3 (×100).圖3　第3代人臍帶間充質干細胞形態

討論

已知受體血小板、凝血因子和補體系統被輸注的外源細胞所激活，產生C3a、Csb-9等炎癥介質，在短時間內致使輸入的細胞及受體的血小板、粒細胞甚至紅細胞等血液成分被大量地破壞損耗，甚至可能引起DIC等致命反應是IBMIR的顯著特征，是影響細胞治療效果的重要因素之一［8，14］。IBMIR在大量消耗輸注的MSC的同時，產生了大量的活化血小板。已有報道顯示，活化的血小板可抑制MSC向凋亡心肌細胞的遷移，進一步降低MSC的作用［15］。

本文按照我們課題組已有程序制備鑒定hUCMSCs，傳代至第3代的hUC-MSCs細胞呈均一梭形成纖維細胞樣聚集貼壁生長，具有向成骨細胞及脂肪細胞分化的潛能，表型為CD105+/CD29+/ CD44+/CD31－/CD34－/CD40－/CD45－/HLA-DR－，與前期結果一致［10，16］，符合首屆胎盤來源干細胞國際研討會及國際細胞治療協會關于MSCs的最低標準［17］。改良的Chandler Loop裝置根據Bennet等［3，11-12］的報道，并參考其它血液循環模型［18-21］構建。正常人非抗凝外周血經該裝置循環1 h各血液成分的損耗率分別為:白細胞(37. 82±13. 81) %、粒細胞(14. 18±0. 39) %、淋巴細胞(2. 36±1. 32) %、單核細胞(30. 92±0. 22) %、血小板(29. 96±10. 88) %，與改良型Chandler Loop模型相近［3］，基本滿足血液體外循環實驗的需求。

Figure 4.The cell surface markers of passage 3.圖4　第3代hUC-MSCs細胞表型鑒定

IBMIR的特征是受體血小板、凝血系統及補體系統同時被激活，以及血液成分和輸注細胞在短時間內的大量損耗［22-23］。1×108/L hUC-MSCs致使循環后各血液成分的損耗率明顯上升，血清C3a含量增加顯著，hUC-MSCs存活率低至(16. 51±8. 29) %，與IBMIR中受體血小板損耗，以及血細胞和輸注細胞的大量破壞丟失相吻合［22-23］。提示hUC-MSCs在改良的Chandler Loop裝置內與正常人血液共循環1 h產生了外源細胞輸入體內所致IBMIR的基本血液學改變及靶細胞損耗［24］。

NAA是維生素B3的主要成分，參與了許多重要的生物學過程，具有抗炎和抗氧化作用［25-26］，體外實驗證實NAA可抑制大鼠胰島細胞表達組織因子及MCP-1，進而抑制IBMIR所致大鼠胰島細胞的損耗［27-29］。已有報道MSCs表達組織因子的量隨傳代而升高［30］，且傳代次數越多的MSCs輸注時發生的IBMIR越強烈，提示組織因子與MSCs輸注所致的IBIMR強度有關［31］。本實驗中參考Jung等［32］的研究并進行預實驗后選擇10 mmol/L為工作濃度，實驗結果顯示，10 mmol/L NAA可明顯降低hUC-MSCs共循環所致血液成分的損耗率，提高hUC-MSCs存活率，抑制IBMIR，提示10 mmol/L NAA對受到輸注損傷的hUC-MSCs具有一定的保護作用。此外，各實驗組與實驗對照組C3a含量差異不明顯，提示在hUCMSCs輸注發生的IBMIR中補體系統激活C3a水平較弱。有關NAA對hUC-MSCs輸注損傷保護作用的量效關系及其機制有待進一步探討。

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(責任編輯:林白霜，余小慧)

Protective effect of nicotinic acid amide on human umbilical cord mesenchymal stem cells

YANG Xiao-lei1，CHEN Zhi-cong1，LIAO Ji-dong1，GU Jing-yi1，YU Bo1，LIU Ge-xiu2
(1Tin Ka-ping Center for Medical Experiments，2Institute of Hematology，School of Medicine，Jinan University，Guangzhou 510632，China.E-mail: tliaojd@jnu.edu.cn)

R363. 2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.10.005

1000-4718(2015)10-1756-06

2015-01-26

2015-04-27

國家自然科學基金資助項目(No.81270568)

△Tel: 020-85225841; E-mail: tliaojd@jnu.edu.cn