載脂蛋白A-I模擬肽D4F通過抑制caspase-12減輕氧化低密度脂蛋白誘導的巨噬細胞凋亡*

田　華，李嚴嚴，丁明德，楊娜娜，焦　鵬，桑　慧，，方永奇，姚樹桐，△，秦樹存△(泰山醫學院動脈粥樣硬化研究所，山東省高校動脈粥樣硬化重點實驗室，附屬醫院，基礎醫學院，山東泰安7000)

載脂蛋白A-I模擬肽D4F通過抑制caspase-12減輕氧化低密度脂蛋白誘導的巨噬細胞凋亡*

田華1▲，李嚴嚴1▲，丁明德2，楊娜娜1，焦鵬1，桑慧1，3，方永奇3，姚樹桐1，3△，秦樹存1△
(泰山醫學院1動脈粥樣硬化研究所，山東省高校動脈粥樣硬化重點實驗室，2附屬醫院，3基礎醫學院，山東泰安271000)

目的:探討載脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I，ApoA-I)模擬肽D4F對氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)誘導的巨噬細胞凋亡和內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)凋亡途徑關鍵分子caspase-12的影響，并闡明其可能的分子機制。方法:體外培養RAW264. 7巨噬細胞，給予12. 5、25和50 mg/ L D4F、5 mmol/L ERS抑制劑4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid，PBA)或5 μmol/L二亞苯基碘鎓(diphenyleneiodonium，DPI)預處理1 h后，再加入100 mg/L ox-LDL或4 mg/L ERS誘導劑衣霉素(tunicamycin，TM)繼續培養24 h。MTT法檢測細胞活力; TUNEL法檢測細胞凋亡情況;試劑盒測定細胞內丙二醛(malondialdehyde，MDA)和活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平，以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶活性; Western blot法檢測caspase-12的表達變化。結果:與ERS抑制劑PBA相似，D4F可抑制ox-LDL或TM所致的巨噬細胞活力降低和凋亡，且呈濃度依賴性(P＜0. 05)。與氧化應激抑制劑DPI相似，D4F顯著抑制ox-LDL誘導的氧化應激反應，表現為ROS和MDA生成減少(P＜0. 01)、SOD活性增加以及NADPH氧化酶活性降低(P＜0. 05) ;與PBA和DPI相似，D4F可減輕ox-LDL誘導的巨噬細胞caspase-12活化，且呈濃度依賴性(P＜0. 05) ;另外，D4F還可抑制TM誘導的caspase-12活化(P＜0. 05)。結論: D4F能夠抑制ox-LDL誘導的巨噬細胞凋亡，其機制至少部分是通過減輕氧化應激繼而抑制caspase-12活化實現的。

載脂蛋白A-I模擬肽D4F; Caspase-12;氧化低密度脂蛋白;巨噬細胞;細胞凋亡

▲并列第1作者

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effect of D4F，an apolipoprotein A-I mimetic peptide，on oxidized lowdensity lipoprotein (ox-LDL) -induced macrophage apoptosis and activation of caspase-12，a key molecule in endoplasmic reticulum stress (ERS ) -associated apoptotic pathway，and to elucidate the underlying molecular mechanisms.METHODS: RAW264. 7 macrophages were pretreated with D4F (12. 5，25 and 50 mg/L)，4-phenylbutyric acid (PBA，5 mmol/L) or diphenyleneiodonium (DPI，5 μmol/L) for 1 h and then treated with ox-LDL (100 mg/L) or tunicamycin (TM，4 mg/L) for 24 h.The cell viability and apoptosis were determined by MTT assay and TUNEL detection，respectively.The levels of malondialdehyde (MDA) and reactive oxygen species (ROS) in the cells and the activities of superoxide dismutase (SOD) and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase were determined.The protein level of caspase-12 was examined by Western blot analysis.RESULTS: Similar to the ERS inhibitor PBA，D4F protectedRAW264. 7 macrophages from ox-LDL or TM (an ERS inducer) -induced decrease in the viability and increase in apoptotic rate in a dose-dependent manner.Like DPI (an oxidative stress inhibitor)，D4F significantly inhibited ox-LDL-induced oxidative stress，as expressed by the decreased generation of ROS and MDA (P＜0. 01)，the increased activity of SOD and the decreased activity of NADPH oxidase (P＜0. 05).Moreover，similar to PBA and DPI，D4F significantly suppressed ox-LDL-induced activation of caspase-12 in a concentration-dependent manner (P＜0. 05).Furthermore，D4F also inhibited the caspase-12 activation induced by TM (P＜0. 05).CONCLUSION: D4F inhibits macrophage apoptosis induced by ox-LDL，and the mechanism is at least partially by reducing oxidative stress and inhibiting the activation of caspase-12.

［KEY WORDS］Apolipoprotein A-I mimetic peptide D4F; Caspase-12; Oxidized low-density lipoprotein; Macrophage; Apoptosis

巨噬細胞源性泡沫細胞形成是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)斑塊的重要病理學標志，且其大量凋亡是易損斑塊形成、破裂的重要因素，進而導致AS晚期臨床急性心血管事件的發生［1］，而由C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)和caspase-12等信號分子介導的內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)凋亡途徑是導致巨噬細胞凋亡的重要機制［2］。因此，干預巨噬細胞ERS凋亡途徑對阻止AS進展、降低急性心血管事件發生率具有重要意義［3］。近年來研究表明高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)主要蛋白成分載脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I，ApoA-I)的模擬肽D4F具有促進巨噬細胞中膽固醇流出、抗炎、抗氧化和抗AS功能［4-6］。本實驗室既往研究證實，D4F可抑制氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)誘導的人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)損傷，且促進小鼠骨髓源內皮祖細胞功能，減輕其損傷［7-8］。另外，我們新近研究表明D4F可通過抑制CD36的表達和ERS-CHOP途徑減輕巨噬源性泡沫細胞凋亡［9］。然而D4F是否通過抑制介導ERS凋亡途徑的另一關鍵分子——caspase-12的活化來減輕ox-LDL所誘導的巨噬細胞凋亡?其上游分子機制又如何?上述問題的解決將為進一步闡明D4F的抗AS機制提供新的實驗依據。本工作分別在ox-LDL和ERS誘導劑衣霉素(tunicamycin，TM)所誘導的RAW264. 7巨噬細胞泡沫模型和ERS模型上，研究D4F對caspase-12活化和氧化應激反應的影響，以進一步分析其對巨噬細胞的保護作用和機制。

材料和方法

1主要試劑

D4F(Ac-DWFKAFYDKVAEKFKEAF-NH2)和紊亂模擬肽(scrambled D4F，sD4F; Ac-DWFAKDYFKKAFVEEFAK-NH2)購自中科亞光多肽服務公司; DMEM高糖培養基和胎牛血清(Gibco) ; ox-LDL(北京協生生物科技有限公司) ; 2’，7’-二氯熒光素二乙酸酯(2’，7’-dichlorofluorescein diacetate，DCHFDA)購自Molecular Probes; 4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid，PBA)、衣霉素(tunicamycin，TM)、二亞苯基碘鎓(diphenyleneiodonium，DPI)和抗β-actinⅠ抗購自Sigma;四甲基偶氮唑藍［3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl) -2，5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT］購自Genview;末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記［terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT) -mediated dUTP nick end labeling，TUNEL］凋亡檢測試劑盒購自Roche;抗caspase-12Ⅰ抗(Abcam) ;辣根過氧化物酶標記Ⅱ抗(北京中杉金橋公司) ;增強化學發光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒(Pierce) ;二氟化樹脂(polyvinylidene fluoride，PVDF) 膜(Millpore) ;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶測定試劑盒(上海杰美科技公司) ;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

2方法

2.1細胞培養與實驗分組鼠源RAW264. 7巨噬細胞由中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所細胞庫提供，用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養基，于37℃、含5% CO2的培養箱內培養，待細胞長至瓶底80%左右用于實驗，處理前用無血清培養基同步化12 h。隨機分為(1)正常對照(control)組:培養液中常規培養; (2) ox-LDL組:培養液中加入100 mg/L ox-LDL; (3) D4F預處理組:培養液中預先加入D4F (12. 5、25和50 mg/L)作用1 h，再加入100 mg/L ox-LDL; (4) sD4F預處理組:培養液中預先加入sD4F (50 mg/L)作用1 h，再加入100 mg/L ox-LDL; (5) ERS抑制劑PBA預處理組:培養液中預先加入5 mmol/L PBA作用1 h，再加入100 mg/L ox-LDL; (6)氧化應激抑制劑DPI預處理組:培養液中預先加入5 μmol/L DPI作用1 h，再加入100 mg/L ox-LDL。另外培養RAW264. 7巨噬細胞，預先給予50 mg/L D4F 或sD4F作用1 h，然后與ERS誘導劑TM (4 mg/L)共孵育。培養24 h后收集細胞。

2.2MTT法檢測細胞活力胰酶消化細胞后接種于96孔板中，經處理后每孔加入20 μL(0. 5 g/L)的MTT，對照組加入PBS，避光37℃培養4 h，然后吸去培養液，加入150 μL DMSO后室溫振蕩10 min; 490 nm波長下，應用多功能酶標儀(Tecan)測定各孔的吸光度(A)值。以正常對照組細胞活力為100%，其余各組細胞活力以其A值占正常對照組A值的百分比表示，對結果進行統計分析。

2.3TUNEL法檢測細胞凋亡在室溫下，用4%多聚甲醛固定細胞30 min后，用PBS沖洗，然后用0. 1%的Triton X-100透化，在冰上孵育2 min。TUNEL反應混合物加入到細胞中，并在37℃避光孵育1 h，然后PBS洗滌細胞2次，每次5 min，再用DAPI溶液染色。應用熒光顯微鏡(Olympus)檢測，以TUNEL陽性細胞與細胞總數之比來計算細胞凋亡比率。

2.4活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平測定

將細胞接種于96孔板，經處理后，裝載DCHF-DA熒光探針，使其終濃度為10 μmol/L。在無血清DMEM中37℃孵育30 min后，洗細胞3次。多功能酶標儀(Qiagen)檢測，激發波長為488 nm，發射波長為525 nm。以對照組ROS水平為100%，其它各組ROS水平以其熒光強度占對照組熒光強度的百分比表示。

2.5SOD活性和MDA含量測定細胞經處理后，收集并重懸于0. 5 mL裂解緩沖液中充分裂解，1 500 r/min離心10 min，應用試劑盒根據說明書檢測上清液中SOD活性和MDA含量，分別用×103U/g蛋白和μmol/g蛋白表示。

2.6NADPH氧化酶活性測定應用光澤精增強化學發光法測定細胞內NADPH氧化酶活性，具體方法依據試劑盒說明書操作。

2.7Western blot實驗按本室以往報道的方法［10］提取細胞總蛋白，等量的各組總蛋白于SDS-PAGE分離，待目的蛋白接近凝膠底部時停止電泳，4℃、100 V恒壓電轉移至PVDF膜上，經5%脫脂奶粉封閉、洗脫后與caspase-12多克隆Ⅰ抗(1∶1 000)和βactin (1∶6 000)單克隆Ⅰ抗室溫孵育4 h，洗膜后與相應Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL顯色抗原-抗體復合物，應用化學發光成像儀(上海歐翔科學儀器有限公司)進行圖像采集。蛋白條帶積分光密度(IA)值采用Image-Pro Plus 6. 0圖像分析軟件(Media Cybernetics)分析，以靶蛋白IA值/β-actin IA值的比值表示靶蛋白相對水平。

3統計學處理

數據用平均值±標準差(mean±SD)來表示。應用SPSS 13. 0統計軟件進行單因素方差分析(oneway ANOVA)，以SNK法進行組間兩兩比較。以P＜ 0. 05為差異有統計學意義。

結果

1D4F抑制ox-LDL和TM誘導的RAW264. 7細胞活力降低

RAW264. 7細胞經ox-LDL(100 mg/L)處理24 h，MTT檢測細胞存活率降低47. 6%。然而，與ox-LDL處理組相比，用不同劑量的D4F(12. 5、25和50 mg/L)預處理細胞，細胞存活率劑量依賴性增加，分別升高27. 6%、53. 2%和60. 5% (P＜0. 05) ; ERS抑制劑PBA作為陽性對照預處理細胞后，也減輕了細胞活力的下降(P＜0. 05)，而紊亂模擬肽sD4F無此作用。此外，與ERS誘導劑TM處理組相比，用D4F (50 mg/L)預處理細胞1 h，細胞存活率升高了27. 7%(P＜0. 05)，見圖1。

Figure 1.D4F inhibited ox-LDL-or TM-induced decrease in viability of RAW264. 7 cells.Mean±SD.n = 6.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs control group;#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs ox-LDL group;△P＜0. 05 vs TM group.圖1　D4F抑制ox-LDL和TM所誘導的RAW264. 7巨噬細胞活力降低

2D4F抑制ox-LDL和TM誘導的RAW264. 7細胞凋亡

TUNEL染色證實D4F的抗凋亡作用。與ox-LDL處理組比較，用D4F(25和50 mg/L)預處理，細胞凋亡率分別降低了37. 7%和44. 3% (P＜0. 01)，結果與PBA預處理組相似，而sD4F預處理無此作用;同樣，D4F也可以抑制TM誘導的細胞凋亡，凋亡率降低25. 9%(P＜0. 05)，提示D4F可能通過抑制ERS信號途徑減輕巨噬細胞凋亡，見圖2。

Figure 2.D4F inhibited ox-LDL-or TM-induced apoptosis of RAW264. 7 cells.RAW264. 7 cells were pretreated with D4F，sD4F or PBA and then incubated with ox-LDL.The cell apoptosis was detected by TUNEL assay.The scale bar =20 μm.Mean± SD.n =6.＊＊P＜0. 01 vs control group;#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs ox-LDL group;△P＜0. 05 vs TM group.圖2　D4F抑制ox-LDL和TM所誘導的RAW264. 7巨噬細胞凋亡

3D4F抑制ox-LDL和TM誘導的caspase-12活化

采用Western blot法檢測caspase-12的剪切活化水平(cleaved caspase-12)，與ox-LDL處理組比較，D4F (25、50 mg/L)預處理組cleaved caspase-12水平減少了49. 8%和59. 0%(P＜0. 05)，其對caspase-12活化的抑制作用與PBA和NADPH氧化酶抑制劑DPI的作用相似，但是sD4F無此作用;同樣，D4F也可抑制TM誘導的caspase-12活化(P＜0. 05)，見圖3。

4D4F抑制ox-LDL誘導的氧化應激反應

與ox-LDL組比較，D4F可以明顯降低細胞內ROS水平和MDA含量(P＜0. 01)，并升高SOD活性(P＜0. 05)，其作用與DPI相似，見圖4。

5D4F抑制ox-LDL所誘導的NADPH氧化酶活化

與DPI相似，D4F可以明顯抑制ox-LDL所誘導的細胞內NADPH氧化酶活化，其活性較ox-LDL組降低28. 8%(P＜0. 05)，見圖5。

討論

在晚期AS病變中，富含脂質的巨噬細胞凋亡可促進病灶炎性反應、壞死和脂質核心擴大，這可導致斑塊破裂和血栓形成，進而引起急性心梗、心源性猝死等急性心血管事件的發生［1］，因此，抑制巨噬細胞凋亡可能有效降低急性心血管事件的發生率。HDL是公認的具有膽固醇逆向轉運、抗炎、抗氧化等抗AS作用的“好膽固醇”，ApoA-I是其主要蛋白成分和功能執行者。但是在AS患者體內HDL亞組分改變，如ApoA-I等蛋白成分因氧化或糖基化修飾而使其抗AS功能明顯降低，且由于ApoA-I分子量大，制造起來非常困難并且昂貴，因此限制了其臨床應用［11］。D4F是采用生物技術研制的18個氨基酸片段的Apo A-I模擬肽，具有Apo A-I類似的A型兩親性螺旋結構，能夠促進泡沫細胞中膽固醇流出，抑制炎癥和氧化應激反應，并可抑制AS小鼠粥樣斑塊進展［4-6，12］。我們既往研究證實，D4F可減輕ox-LDL所誘導的HUVECs損傷［7］，并可下調巨噬源性泡沫細胞清道夫受體A1表達［10］。本實驗結果表明，D4F可抑制ox-LDL所誘導的RAW264. 7巨噬細胞損傷，表現為細胞活力增加、凋亡率降低。

內質網是真核細胞內進行蛋白質合成、加工、運輸和鈣儲存的重要場所，也是損傷感知或凋亡信號整合的主要位點。氧化應激、鈣穩態失衡、膽固醇超負荷等理化改變均可導致內質網功能紊亂，出現以未折疊/誤折疊蛋白聚集和鈣穩態失衡為主要特征的ERS反應。一定程度ERS通過暫時性減少蛋白質的合成、增強蛋白質的折疊及加快未折疊蛋白的轉運等來減輕內質網的負荷，從而達到維持內質網功能和細胞生存的目的。但是過強或過久的ERS則可通過激活CHOP、caspase-12等信號途徑觸發細胞凋亡［2］。我們前期研究證實ox-LDL誘導的巨噬細胞凋亡是由ERS-CHOP信號途徑介導的，而D4F可通過抑制該信號途徑減輕ox-LDL對巨噬細胞凋亡的誘導作用［9，13］。Caspase-12是介導ERS凋亡機制的另一關鍵蛋白酶，定位于內質網膜，以酶原形式存在，在ERS時被特異性剪切激活，進而通過激活caspase-9和caspase-3，啟動一系列caspase級聯反應而誘導細胞凋亡［14］。文獻報道，ox-LDL通過激活caspase-12誘導HUVECs凋亡［15］。本實驗結果顯示，以100 mg/L ox-LDL處理RAW264. 7巨噬細胞24 h，caspase-12剪切活化水平顯著上調，而ERS抑制劑PBA不僅可明顯抑制ox-LDL所誘導的巨噬細胞損傷和凋亡，而且可減輕caspase-12活化，表明caspase-12是介導ox-LDL所致巨噬細胞凋亡的重要機制之一。與PBA相似，D4F不僅可減輕ox-LDL所誘導的巨噬細胞活力降低和凋亡，而且可抑制ERS誘導劑TM所誘導的細胞損傷和凋亡，另外對ox-LDL和TM所誘導的caspase-12活化均具有明顯抑制作用，表明D4F可通過抑制caspase-12活化減輕ox-LDL所誘導的巨噬細胞凋亡。

Figure 3.D4F inhibited ox-LDL- or TM-induced activation of caspase-12.RAW264. 7 cells were pretreated with D4F (12. 5，25 and 50 mg/L)，sD4F (50 mg/L)，PBA (5 mmol/L) or DPI (5 μmol/L) for 1 h and then incubated with ox-LDL (100 mg/L) for 24 h.The protein levels of caspase-12 were examined by Western blot analysis.Mean±SD.n = 3.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs control group;#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs ox-LDL group;△P＜0. 05 vs TM group.圖3　D4F抑制ox-LDL和TM所誘導的caspase-12活化

Figure 4.Inhibitory effects of D4F on ox-LDL-induced oxidative stress in RAW264. 7 cells.The cells were pretreated with D4F (50 mg/L) or DPI (5 μmol/L) for 1 h and then stimulated with ox-LDL (100 mg/L) for 24 h.Mean±SD.n =6.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs control group;#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs ox-LDL group.圖4　D4F抑制ox-LDL所誘導的氧化應激反應

有研究證明ox-LDL的主要氧化脂質成分7-酮膽甾醇(7-ketocholesterol，7-KC)經氧化應激反應引發人動脈平滑肌細胞［16］和兔動脈平滑肌細胞發生ERS［17］，表明氧化應激可觸發ERS反應。本研究結果顯示，氧化應激抑制劑DPI可抑制ox-LDL所致的caspase-12活化，表明ox-LDL通過氧化應激反應激活caspase-12介導的ERS凋亡信號途徑。ox-LDL誘導的氧化應激主要來自NADPH氧化酶衍生的ROS生成過度和抗氧化酶活性的降低［18］。我們前期工作證實，D4F可通過抑制氧化應激增加色素上皮衍生因子的表達來減輕ox-LDL誘導的HUVECs損傷［7］。本研究結果顯示，與DPI相似，D4F可抑制ox-LDL所誘導的NADPH氧化酶活化以及ROS和MDA生成，并上調SOD活性，提示D4F對caspase-12的抑制作用與其減輕氧化應激反應相關。

總之，本實驗結果表明D4F可減輕ox-LDL所誘導的RAW264. 7巨噬細胞凋亡，其機制可能與減輕氧化應激繼而抑制caspase-12活化有關。

Figure 5.D4F inhibited ox-LDL-induced NADPH oxidase activation in RAW264. 7 cells.The cells were treated as described and then the activity of NADPH oxidase was determined by lucigenin chemiluminescence.Mean± SD.n =6.＊＊P＜0. 01 vs control group;#P＜0. 05 vs ox-LDL group.圖5　D4F抑制ox-LDL所誘導的NADPH氧化酶活化

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(責任編輯:林白霜，羅森)

Apolipoprotein A-I mimetic peptide D4F protects macrophages from oxidized low-density lipoprotein-induced apoptosis by inhibiting caspase-12

TIAN Hua1，LI Yan-yan1，DING Ming-de2，YANG Na-na1，JIAO Peng1，SANG Hui1，3，FANG Yong-qi3，YAO Shu-tong1，3，QIN Shu-cun1
(1Institute of Atherosclerosis，Key Laboratory of Atherosclerosis in Universities，2Affiliated Hospital，3College of Basic Medical Sciences，Taishan Medical University，Taian 271000，China.E-mail: yst228@126.com; shucunqin@hotmail.com)

R363. 2; R332

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.10.004

1000-4718(2015)10-1750-06

2015-04-23

2015-05-07

國家自然科學基金資助項目(No.81202949; No.81370381) ;山東省自然科學基金聯合專項(No.ZR2014HL013) ;山東省醫藥衛生科技發展計劃(No.2013WSB31009)

△姚樹桐Tel: 0538-6225010; E-mail: yst228@126.com;秦樹存Tel: 0538-6237252; E-mail: shucunqin@hotmail.com