DNA處理蛋白A在細菌自然轉化中的作用

余 昳，劉長庭

解放軍總醫院 南樓呼吸科，北京 100853

DNA處理蛋白A在細菌自然轉化中的作用

余 昳，劉長庭

解放軍總醫院 南樓呼吸科，北京 100853

自然轉化是水平基因轉化的一種基因編程機制，是細菌通過水平基因轉移獲得新的遺傳信息的一種途徑。DNA處理蛋白A(DNA processing protein A，DprA)是一種保守蛋白，它參與自然轉化的多個環節，可以結合單鏈DNA并保護其免受核酸酶損傷；與重組酶A相互作用，利于重組酶A裝載到裸露的單鏈DNA及被單鏈DNA結合蛋白覆蓋的單鏈DNA上，隨后進行染色體同源搜索及配對，可以減弱單鏈DNA結合蛋白的屏障作用，通過限制感受態刺激因子的早期基因表達，參與細胞感受態的關閉過程。本文對DprA蛋白在細菌自然轉化中的作用進行綜述。

DNA處理蛋白A；細菌；自然轉化

自然轉化是一種重要的生物學現象，它是細菌水平基因轉化的一種基因程控機制。不同于轉導或接合等其他機制，它利用DNA攝取泵導入DNA，不需要額外染色體或移動因子[1]。細菌自然轉化的意義：抗藥性基因在病原菌之間快速水平轉移，以自然轉化過程中攝取的外源DNA為模板，通過同源重組方式修復受損染色體，是維持遺傳多樣性、促進細菌進化的一種途徑。自然轉化過程需要重組酶A、單鏈DNA結合蛋白、DNA處理蛋白A(DNA processing protein A，DprA)；其中DprA在自然轉化過程中有重要作用[2]。1995年Karudapuram等[3]在流感嗜血桿菌中首次發現DprA并命名，本文從結構、功能、研究、展望等方面對其進行綜述。

1 DprA的結構

1.1 DprA的單體結構 DprA是一中廣泛分布的細菌蛋白，在317株完全測序細菌基因組中85%存在DprA[4]。它由約300個氨基酸組成，不同菌種的DprA所含氨基酸數略有差異。這些氨基酸構成山姆結構域(SAM)、DNA-processg-A區和果蠅美里樣蛋白1(DML1)區(圖1)[5]。DprA的二級結構由9個α螺旋和9個β鏈組成一個經典的羅斯曼折疊(圖2)[5]。

1.2 DprA二聚體的結構 研究表明，DprA自身形成二聚體后，才能結合單鏈DNA，進而幫助重組酶A裝載到單鏈DNA上，完成后續轉化過程[6]。DprA主要靠殘基Pro183、Leu196和Phe205的分子間疏水作用形成二聚體，此外殘基Arg185和Glu188之間的四個氫鍵加強了這個二聚作用(圖3)[5]。

1.3 DprA與單鏈DNA的結合模型 幽門螺桿菌的DprA上有兩個小的帶正電荷的結合口袋，這兩個結合口袋有經典羅斯曼折疊，DprA二聚體通過這兩個口袋結合單鏈DNA。殘基Arg52可以調整開放的口袋，以容納一個單鏈DNA的基底，使得DprA牢固地抓住單鏈DNA的基底。經凝膠遷移滯后實驗和靜態光散射測量，這個模式為DprA與單鏈DNA摩爾比為1∶1的低聚物[5]。而肺炎鏈球菌的DprA-單鏈DNA是直接聚合體[4]。

1.4 DprA二聚體與重組酶A的互作模型 根據體外單分子研究，重組酶A單體折疊成3個域，有3個殘基，可以對接DprA，其核心區域包含ATP結合位點，朝向核蛋白絲的內部，有兩個無序環作為單鏈DNA結合位點的一部分[7]。重組酶A的C末端區域位于核蛋白絲的外表面，結合單鏈DNA。N末端區域折疊成一個α-螺旋，對著核蛋白絲的鄰亞單位，這個α-螺旋通過一個長鏈接與核心區域連接[8-9]。近期研究表明，在DprA二聚體和重組酶A互作界面有一個重疊區，DprA-DprA同源二聚體被DprA-重組酶A異源二聚體替代，使得重組酶A可以在DNA上成核并聚合，隨后進行染色體同源搜索及配對[6]。

圖 1 3種同源DprA的序列比對 (Rp-枯草桿菌、Sp-肺炎鏈球菌、Hp-幽門螺旋桿菌)[5]★二聚體界面的疏水殘基； ●結合口袋的保守殘基； ▲單鏈DNA的結合殘基Fig. 1 Sequence alignment of three homologous DprA proteins (R. palustris, S. pneumonia and H. pylori.)

圖 2 DprA的二級結構 (9個α螺旋和9個β鏈)[5]圖 3 DprA二聚體結構[5]Fig. 2 Secondary structure elements of DprA monomerFig. 3 Dimer of DprA

2 DprA的功能

在60多個自然轉化感受態細菌中，枯草桿菌和肺炎鏈球菌被作為革蘭陽性菌的自然轉化模型，而淋病奈瑟菌和流感嗜血桿菌則是革蘭陰性菌的模型。通過研究這些細菌，發現自然轉化一般分3步：外源DNA結合到細菌表面；運輸外源DNA穿過細胞膜；供體DNA同源重組到受體染色體或質粒上[10-11]。另外，研究還發現DprA參與自然轉化的多個環節：結合線形和環形單鏈DNA，保護單鏈DNA免受核酸酶損傷；與重組酶A相互作用，利于重組酶A裝載到裸露的單鏈DNA及被單鏈DNA結合蛋白覆蓋的單鏈DNA上，隨后進行染色體同源搜索及配對；減弱單鏈DNA結合蛋白的屏障作用；限制感受態刺激因子的早期基因表達，參與細胞感受態的關閉過程。

2.1 DprA保護單鏈DNA免受核酸酶降解 枯草桿菌DprA和肺炎鏈球菌DprA都具有顯著的單鏈DNA結合活性，基本對于雙鏈DNA沒有親和力，與單鏈DNA結合蛋白相比，盡管DprA不打開單鏈DNA二級結構，但它聚集在DNA易接近的細胞極區域[4]。DprA和重組酶A交替出現在細胞極上，DprA在細胞極上時重組酶A在細胞中心。DprA結合了DNA后從細胞極移到細胞中心，此時重組酶A回到細胞極上，結合了DNA后的重組酶A再從細胞極移到細胞中心[12]。在DprA缺失的感受態細胞中，內化的DNA被完全毀壞，表明DprA在保護單鏈DNA免受核酸酶降解過程中起著重要作用[2]。通過純化并標記DprA蛋白的方法發現，DprA結合線形和環形單鏈DNA，可以保護單鏈DNA免受各種核酸酶降解[4]。

2.2 DprA促進重組酶A裝載于單鏈DNA 重組酶A是基因轉化必需的，可以催化DNA的連接[13]。重組酶A在同源重組過程中起著DNA重組修復、誘導細胞應急反應、重啟復制叉的作用，所有這些活性需要在單鏈DNA上加載重組酶A，形成重組酶A-ATP-單鏈DNA核蛋白絲才能發揮作用[2]。Mortier-Barr iè re等[4]在從肺炎鏈球菌感受態細胞中純化C末端組氨酸被標記的重組酶A時，同時獲得了DprA，證明了這兩個蛋白存在相互作用。它們還通過酵母雙雜交試驗證實了枯草桿菌DprA和肺炎鏈球菌重組酶A以及肺炎鏈球菌DprA和枯草桿菌重組酶A之間的跨物種的相互作用[4]。體外實驗表明，DprA促進DNA結合，利于重組酶A裝載到裸露的單鏈DNA上，由此產生DprA-重組酶A-單鏈DNA核蛋白絲，使得同源DNA分子連接起來。較之雙鏈DNA，DprA更易于結合單鏈DNA并與重組酶A互作，利于重組酶A裝載到單鏈DNA上形成核蛋白絲結構，激活重組酶A上的單鏈DNA依賴的ATP酶活性，觸發重組酶A催化的同源底物之間平行和螺旋連接[4]。

2.3 DprA減弱單鏈DNA結合蛋白屏障 單鏈DNA結合蛋白可以促進轉化，其缺失使得轉化減少了3 ～ 5倍[2]。通常單鏈DNA結合蛋白結合并瓦解單鏈DNA的二級結構[14]。但當DprA結合單鏈DNA后，利于從單鏈DNA上解除一部分單鏈DNA結合蛋白[15]。研究表明，重組酶A上存在著單鏈DNA依賴的ATP酶，當單鏈DNA被飽和數量的單鏈DNA結合蛋白覆蓋后，單鏈DNA依賴的ATP酶活性被減弱，而增加DprA的數量可以競爭性地還原這些ATP酶的活性，證明DprA抵消了單鏈DNA結合蛋白對這些ATP酶的抑制作用[4]。DprA抵消了單鏈DNA結合蛋白屏障時，單純的重組酶A核絲形成；單鏈DNA結合蛋白缺失時，混合的DprA-重組酶A核蛋白絲形成。Mortier-Barrière等[4]借助透射電子顯微鏡觀察DprA與被單鏈DNA結合蛋白覆蓋的單鏈DNA之間相互作用，發現DprA結合到單鏈DNA結合蛋白-ssDNA復合體上，這樣利于重組酶A核鏈裝載到被單鏈DNA結合蛋白覆蓋的單鏈DNA上。DprA的存在克服了單鏈DNA結合蛋白對重組酶A裝載的抑制作用，利于重組酶重組酶A介導有單鏈結合蛋白單鏈DNA結合蛋白存在的DNA鏈交換[4]。

2.4 DprA參與細胞感受態的關閉 自然轉化中感受態是必不可缺的環節，絕大多數能夠自然轉化的細菌感受態期十分短暫，突然開始又迅速結束，感受態調控機制復雜[16]。感受態是受ComE蛋白調控，ComE蛋白的反饋調控子被磷酸化后，激活感受態特性σX因子，使得感受態刺激因子水平升高，導致所有的細胞變成感受態[17]。研究表明，受σX因子控制的DprA與ComE～P蛋白相互作用，阻礙ComE蛋白轉錄表達，影響σX因子產量；擾亂DprA與ComE蛋白的互作，可以加速感受態的關閉[18]。

3 展望

肺炎球菌和枯草桿菌的DprA基因存在于感受態誘導的調節子中[4,19-20]。在肺炎球菌中，感受態僅持續一段極短的時間，而DprA只在這個極短的時間內被表達[18]。但在莢膜紅細菌中，DprA在穩定期被表達[21]。早期研究認為，DprA只結合單鏈DNA不結合雙鏈DNA[4]。然而，近年來在研究幽門螺桿菌中發現，DprA既結合單鏈DNA也結合雙鏈DNA，被DprA覆蓋的單鏈DNA和雙鏈DNA可以免受核酸酶降解，而且雙鏈DNA被甲基化而強化，從而認為DprA可以減弱幽門螺桿菌自然轉化的限制屏障[19]。DprA有助于重組酶A介導的自然轉化，但對同源重組并不是必不可少[4,22]。近期有研究指出，在莢膜紅細菌中，DprA同源體可以影響細菌的同源重組接受能力，而且發現，所有產GTA的細菌中都具備這種DprA同源體。雖然DprA是一種保守蛋白，我們通過全基因組、蛋白組及轉錄組的測序比對，發現暴露于太空環境后的屎腸球菌中DprA基因出現突變[23]，這為DprA的研究提供了一個新思路。

通過不斷研究，DprA的作用逐漸被人們所認識。DNA處理蛋白A參與細菌自然轉化的多個環節，在抗藥性基因在病原菌之間的轉移中發揮重要作用，如保護單鏈DNA免受核酸酶降解、促進重組酶A裝載于單鏈DNA、減弱單鏈DNA結合蛋白屏障、參與細胞感受態的關閉。借助于空間搭載技術，我們將更深入地了解DprA在細菌自然轉化中的作用，能否以DprA為藥物靶點從而改變細菌對抗藥基因自然轉化的能力，是值得我們密切關注和深入研究的課題。

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Role of DNA processing protein A in natural transformation of bacteria

YU Yi, LIU Changting
Department of Respiratory Diseases in South Building, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

LIU Changting. Email: changtingliu@sohu.com

Natural transformation is a genetically programmed mechanism of horizontal gene transfer in bacterial, which is a way for bacteria to obtain new genetic information. DNA processing protein A (DprA) is a conserved protein, which is involved in multiple aspects of natural transformation: DprA can bind and protect ssDNA, interact with RecA, promote the loading of RecA on ssDNA, alleviate the SSB barrier, and it also involves in the closing process of competent cells. In this article, the role of DprA in the natural transformation of bacteria is reviewed.

DNA processing protein A; bacteria; natural transformation

Q 933

A

2095-5227(2015)10-1052-04 DOI：10.3969/j.issn.2095-5227.2015.10.024

時間：2015-06-12 10:02

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150612.1002.001.html

2014-08-07

國家“973”重點基礎研究發展規劃項目(2014CB744400)；國家自然科學基金項目(81350020)；全軍醫學科研“十二五”課題重點項目(BWS12J046)；載人航天領域項目(040203)

Supported by National“ 973” Program for Basic Science Research Development of China (2014CB744400); National Natural Science Foundation of China (81350020); Military Special-purpose Program of "Twelfth Five-Year"(WS12J046); Program of Manned Spaceflight(040203)

余昳，女，博士，主治醫師。研究方向：呼吸病學、微生物學。Email: yiyu2016@163.com

劉長庭，主任醫師，教授，博士生導師。Email: changti ngliu@sohu.com