基于性狀—顯微—DNA條形碼聯(lián)用的巴西牛至屬植物藥HORTELA基原鑒定研究

余春霞 臧藝玫 顧選 吳浩忠 馬長華 韓麗 劉春生 趙百孝

·巴西草藥研究專題·

基于性狀—顯微—DNA條形碼聯(lián)用的巴西牛至屬植物藥HORTELA基原鑒定研究

余春霞 臧藝玫 顧選 吳浩忠 馬長華 韓麗 劉春生 趙百孝

目的 利用性狀—顯微—DNA條形碼聯(lián)用的方法對巴西牛至屬植物藥HORTELA進(jìn)行基原鑒定研究。方法 應(yīng)用性狀鑒定的方法初步對藥材進(jìn)行真?zhèn)舞b別;再應(yīng)用顯微鑒定的方法驗(yàn)證性狀鑒定結(jié)果;最后提取樣品DNA,擴(kuò)增ITS序列,利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST功能分析相似度,對樣品品種進(jìn)行DNA條形碼鑒定。結(jié)果 性狀—顯微—DNA條形碼綜合分析結(jié)果表明,該樣品為牛至屬植物Origanum elongatum(Bonnet)Emb.&Maire.的干燥地上部分。結(jié)論 HORTELA可能為多基原植物類藥材,其來源為牛至屬Origanum elongatum(Bonnet)Emb.&Maire.和薄荷屬M(fèi)entha rotundifolia(Linn.)Huds.干燥地上部分。

牛至屬; 基原鑒定; DNA條形碼

巴西草藥HORTELA是巴西民族的常用藥,作者在巴西市場收集藥材樣本時(shí)發(fā)現(xiàn),HORTELA被人們當(dāng)做圓葉薄荷Mentha Rotundifolia(又稱為Menthasuaveolens)出售及使用,但初步觀察其性狀與圓葉薄荷并不完全相同,因此有必要對該藥材進(jìn)行基原鑒定研究。

傳統(tǒng)的植物藥鑒定有性狀鑒定和顯微鑒定等,二者的優(yōu)點(diǎn)是簡單、易行,不足之處是其主觀性較強(qiáng),且對屬內(nèi)近緣種藥材的鑒別能力較差[1-2]。DNA條形碼鑒定技術(shù)具有高效、準(zhǔn)確、客觀優(yōu)點(diǎn)[3-4],其中內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)序列應(yīng)用最為廣泛[5-6]。本文提出性狀—顯微—DNA條形碼聯(lián)用的方法對植物藥進(jìn)行鑒定,首先通過性狀鑒定初步對藥材進(jìn)行真?zhèn)舞b別,再用顯微鑒定的方法驗(yàn)證性狀鑒定結(jié)果,然后應(yīng)用DNA條形碼鑒定的方法,利用NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中已注冊的ITS序列進(jìn)行相似度分析,確定待測樣品的品種。

本實(shí)驗(yàn)擬采用性狀—顯微—DNA條形碼聯(lián)用的方法對巴西植物藥HORTELA進(jìn)行基原鑒定,為保證其質(zhì)量及安全用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

HORTELA藥材10份,每份200 g,2012年4月購買于巴西隆城市場藥材集散地。樣品的憑證標(biāo)本保存于北京中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)標(biāo)本室。

1.2 試劑

廣譜植物基因組 DNA快速提取試劑盒(北京博邁德生物有限公司,批號:69632855);rTaq酶(上海生工生物工程有限公司,批號:695672BE);乙醇(北京化工廠,批號:1124120381060079);瓊脂糖(BIOWEST,批號:142045);ddH2O等。

1.3 儀器

顯微鏡(OLYMPUSCX-21,中國);SY-601超級恒溫水浴(天津歐諾儀器儀表有限公司);L-901渦旋振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司); JA1103N千分之一精密電子天平;SIGMA3K-15低溫高速離心機(jī)(SIGMA公司);TECHNE TC-3000PCR擴(kuò)增儀;Bio-Rad電泳儀;水平電泳槽(北京六一儀器廠);JS-680B全自動(dòng)凝膠成像分析儀(上海培清科技有限公司);GRANT制冰機(jī);超純水制備系統(tǒng);KQ5200E型超聲波清洗器;SANYO-80℃超低溫冰箱(SANYO公司);DHG-9145A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)等。

1.3 基于性狀的鑒定方法

對HORTELA樣品通過眼觀、手摸、鼻聞、口嘗等方法觀察其形狀、大小、顏色、表面特征、質(zhì)地、折斷面等的性狀特征。

1.4 基于顯微的鑒定方法

每份樣品取30 mg研磨至粉末,取粉末少許,置載玻片上,滴加水合氯醛液,在小火上微微加熱透化,加熱時(shí)需續(xù)加水合氯醛液至透化清晰為度。為避免放冷后析出水合氯醛結(jié)晶,可在透化后加稀甘油少許,再加蓋玻片。在顯微鏡下觀察其顯微特征。

1.5 基于ITS序列的DNA條形碼鑒定方法

取10份樣品,觀察形態(tài),形態(tài)結(jié)果一致。每份樣品取40 mg進(jìn)行DNA提取。各份樣本分別用液氮冷凍后研磨成細(xì)粉,按照廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒操作步驟提取樣品DNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA純度及完整性。采用ITS序列通用引物對樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增,ITS-R:5＇-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA-3＇,ITS-F:5＇-TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG-3＇。PCR擴(kuò)增條件: 50μL體系含2×Taq PCR MasterMix 25μL,ITS-R (5μmol/L)2.5μL,ITS-F(5μmol/L)2.5μL, DNA模板4μL,ddH2O 16μL。PCR擴(kuò)增程序: 94℃預(yù)變性5分鐘,94℃ 變性1分鐘,56℃ 退火1分鐘,72℃ 延伸1分鐘,35個(gè)循環(huán);72℃再延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,條帶單一明亮者即擴(kuò)增成功。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后,送上海生工生物工程有限公司測序部測序。各樣品均采用正向和反向測序,以保證測序的準(zhǔn)確性。

利用ContigExpress軟件對測序獲得的正、反向序列進(jìn)行拼接,以TCGA/T和GACCC/TC作為ITS序列邊界截取ITS序列,然后利用相似度法分析序列。

根據(jù) NCBI中相似度搜索法(basic local alignment search tool,BLAST)功能,檢索樣品的ITS序列,本文以相似度90%以上為屬的鑒定依據(jù),以相似度97%以上的最高相似度物種為物種鑒定依據(jù),獲得鑒定結(jié)果。若BLAST比對后得到的序列相似度均在97%以下,則認(rèn)為數(shù)據(jù)庫中可能未注冊該序列,此時(shí),根據(jù)“基于ITS序列的鑒定方法”僅能鑒定到屬水平;該屬中未注冊序列的物種可能為鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 性狀鑒定結(jié)果

本樣品葉多皺縮卷曲,完全展平后呈闊卵形或闊橢圓形,有的為小碎末。長0.5～1.2 cm,寬0.3～1.2 cm。表面棕褐色或棕綠色,有1 mm左右的白色柔毛;葉背面棕灰色,柔毛較少,可見棕色小點(diǎn)密集,葉脈明顯。葉端漸尖或鈍形,基部截斜,全緣,有短葉柄。有特殊的清涼香氣,味辛辣。莖呈方形,直徑1 mm左右,褐色或棕黃色。葉對生,節(jié)略膨大。皮部易于木部分離,表面光滑。斷面黃白色,髓中空。質(zhì)脆。有特殊的清涼香氣,味酸、澀、微苦。見圖1。

參考《中國植物志》的記載,可知本樣品與圓葉薄荷Mentha rotundifolia(Linn.)Huds.的葉片大小、葉片邊緣鋸齒等性狀特征均不相符合,樣品與牛至屬Origanum植物性狀特征較為符合,但由于鑒定者經(jīng)驗(yàn)有限,暫不能根據(jù)其性狀對該樣品進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。

2.2 顯微鑒定結(jié)果

本品粉末呈棕黃色,其顯微特征如下:薄壁細(xì)胞呈多角形;多為梯紋導(dǎo)管,有時(shí)可見螺紋導(dǎo)管;腺鱗頭部8個(gè)細(xì)胞,柄部為單細(xì)胞;氣孔直軸式;纖維成束。見圖2。

由于顯微特征專屬性不強(qiáng),且缺少參考資料,無法根據(jù)顯微特征對該樣品基原進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。

2.3 DNA條形碼鑒定結(jié)果

10份樣品的測序峰圖良好,測序結(jié)果一致,選擇一條序列用于后續(xù)分析。截取ITS片段后,經(jīng)BLAST分析,樣品ITS序列與牛至屬植物Origanum elongatum(Bonnet)Emb.&Maire.(GU381465.1)、Origanum vulgare(GU381469.1)、Origanum dictamnus (GU381464.1)、Origanum majoranae(JX162835.1)、Origanum rotundifolium(GU381463.1)、Origanum scabrum(EU252138.1)、Origanum syriacum(JX163036.1)、Origanum virens(EU252126.1)、Origanum dayi (GU381466.1)、Origanum onites(JX162994.1)相似度在97%以上,其中,與Origanum elongatum(Bonnet) Emb.&Maire.(GU381465.1)的得分和相似度最高,達(dá)到99%。而樣品ITS序列與薄荷屬圓葉薄荷Mentha rotundifolia(Linn.)Huds(AF369161.1)的相似度為83.76%,遠(yuǎn)低于與牛至屬物種相似度。

根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫,由于樣品與 Origanum elongatum(Bonnet)Emb.&Maire.(GU381465.1)序列相似度為99%,且該物種在巴西分布[7]。因此,鑒定該樣品為Origanum elongatum(Bonnet)Emb.& Maire.,但目前暫無其性狀及顯微鑒定參考依據(jù)。

3 討論

性狀—顯微—DNA條形碼聯(lián)用的鑒定技術(shù)適用于無背景信息或背景信息不準(zhǔn)確的植物藥基原鑒定研究。第一步依據(jù)鑒定者的經(jīng)驗(yàn)對樣品進(jìn)行性狀鑒定,該方法經(jīng)濟(jì)、快速,可鑒別出性狀特征明顯的偽品;第二步通過顯微鑒定方法提高性狀鑒定結(jié)果的客觀性。兩種傳統(tǒng)鑒定方法的聯(lián)合對樣品鑒定的準(zhǔn)確性明顯提高,但對于同屬近緣種樣品的基原判斷仍存在困難,且有相當(dāng)數(shù)量的植物藥性狀及顯微特征未被記載,難以找到參考文獻(xiàn)進(jìn)行比對核實(shí)。鑒于此,本研究團(tuán)隊(duì)在傳統(tǒng)鑒定方法的基礎(chǔ)上,增加了第三步即DNA條形碼鑒定方法,通過樣品的ITS等序列分析對樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定種。性狀—顯微—DNA條形碼三種方法的聯(lián)合實(shí)現(xiàn)了對樣品的多層次鑒定,達(dá)到了植物類藥材準(zhǔn)確、客觀、快速鑒定的要求。

本文研究表明,本次收集的Hortela樣品的基原植物為Origanum elongatum(Bonnet)Emb.&Maire.而非圓葉薄荷Mentha rotundifolia(Linn.)Huds,故植物類藥材Hortela可能存在同名異物現(xiàn)象。薄荷屬植物含有薄荷醇(Menthol)、香芹酮(Carvone)、薄荷酮(Menthone)、α-蒎烯(α-Pinene)、β-蒎烯(PPinene)、檜稀(Sabinene)、檸檬烯(Limonene)等成分[7-8],具有發(fā)汗、退熱、抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛、抗呼吸道過敏等作用[7-9];牛至屬植物主要含有香芹酚(Carvacrol)、百里酚(Thymol)、傘花烴(Cymene)、γ-松油烯(γ-Terpinen)等成分[10-11],有抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫、擴(kuò)張支氣管等功效[12-14]。牛至屬植物與薄荷屬植物藥的化學(xué)成分有差異但功效基本相同,故推測Hortela為多基原植物類藥材,其來源為牛至屬Origanum elongatum(Bonnet)Emb.&Maire.和薄荷屬Origanum elongatum(Bonnet)Emb.&Maire.干燥地上部分,但該結(jié)論仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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The variety identification of HORTELA in Brazil based on a combined analysis ofmacroscopic-m icroscopic-DNA barcoding

YU Chun-xia,ZANG Yi-mei,GU Xuan,et al.Henan Province for DrugEvaluation Certification Center,Zhengzhou 450004,China

LIU Chun-sheng,E-mail:max_liucs@263.net

Objective To study the variety identification of HORTELA of Origanum Linn.in Brazil with a combined analysis ofmacroscopic-microscopic-DNA barcoding.M ethods Macroscopic identification was used to identify the authenticity of samples preliminarily;then the resultswas verified bymicroscopic identification;finally,ITS sequences were amplified by PCR and sequenced,and BLAST in NCBI(basic local alignment search tool)database was used to calculate the similarity of sequences to identify variety of samples.Results The combined analysis of macroscopic-microscopic-DNA barcoding indicated that Hortela collected from market in Brazil is the dried overground part of Origanum elongatum (Bonnet)Emb.&Maire.Conclusion HORTELA may be amulti-source herb,which originates from the dried overground part of Origanum elongatum(Bonnet)Emb.&Maire and Mentha rotundifolia(Linn.)Huds.

Origanum Linn.; Variety identification; DNA barcoding

R284.1

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.11.009

2015-08-18)

(本文編輯:蒲曉田)

國家國際科技合作專項(xiàng)(2011DFA31370)

450004 鄭州,河南省藥品審評認(rèn)證中心(余春霞);北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院[臧藝玫(碩士研究生)、顧選、吳浩忠、劉春生、馬長華],針灸推拿學(xué)院(趙百孝),中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)研究所[韓麗(碩士研究生)];北京華邈中藥工程技術(shù)開發(fā)中心(顧選)

余春霞(1972-),女,本科,工程師。研究方向:中藥制劑與分析。E-mail:ycxzzh@126.com

劉春生(1964-),教授,博士生導(dǎo)師。研究方向:藥用植物與分子生藥學(xué)。E-mail:max_liucs@263.net