基于“二維特征鑒別法”的巴西草藥TANCHAGEM真偽鑒別

徐文英 馬愷悅 馮孟鑫 顧選 李妍芃 趙百孝 劉春生 馬長華 韓麗

車前草為車前科Plantaginaceae植物車前Plantago asiatica L．或平車前Plantago depressa wild．的干燥全草，是2010年版《中華人民共和國》(一部)收載的常用中藥。車前草性寒，味甘，具有清熱利尿、祛痰、涼血、解毒之功效，用于水腫尿少、暑濕瀉痢、痰熱咳嗽、癰腫瘡毒等癥［1］。TANCHAGEM為巴西的常用草藥，根據《葡漢詞典》［2］，TANCHAGEM 在葡萄牙語中意為車前草，其藥物性狀與功能主治也與中藥車前草類似，但由于巴西各地區間發展不平衡，其民族藥的研究開發往往存在缺少文獻記載、品種混亂、基原不清、品質不詳等現象［3］。因此，為解決上述質量控制中存在的問題，本課題組對巴西草藥TANCHAGEM進行全面的質量研究，提出了一種新型研究思路“二維特征鑒別法”，即從藥物本身的化學特征和遺傳學特征兩方面入手，先采用DNA條形碼技術對藥物的基原進行確定，解決“真偽問題”;再通過HPLC技術對藥物的化學信息進行檢測，解決“優劣問題”。

首先采用DNA條形碼技術并利用ContigExpress軟件，檢索NCBI中注冊的與巴西草藥相似度最高的物種，以相似度97%以上為物種溯源依據，確定其基原。其次以車前草的專屬性成分大車前苷為其指標成分，利用HPLC法比較巴西草藥TANCHAGEM與中藥車前草中大車前苷的含量，綜合兩者結果為巴西草藥TANCHAGEM及相關制劑的質量標準制訂提供科學依據［4-10］。

1 材料與儀器

1．1 材料

藥材:巴西草藥TANCHAGEM三份(巴西隆城市場)，樣品的憑證標本保存于北京中醫藥大學大學標本室;中藥車前草(北京市花家地南里同仁堂藥店，經北京中醫藥大學劉春生教授鑒定為車前科植物車前Plantago asiatica L．的干燥全草)，大車前苷(中國藥品生物制品鑒定所，批號:111833-201102)。試劑:乙腈(色譜純，Fisher)，甲醇(色譜純，Fisher)，娃哈哈純凈水，液氮。

1．2 儀器

植物DNA提取試劑盒(北京博邁德生物有限公司，批號:69691125)、TProfessiona型PCR擴增儀(德國 Biometra公司，批號:20092237)、ContigExpress軟件、FW400A高速萬能粉碎機(北京科偉永興儀器有限公司)、Sartorius BS110S分析天平、KQ-400KDE型高功率數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、Waters 1525高效液相色譜儀(美國Waters公司)、Breeze 2 HPLC色譜工作站，Waters 2998二極管陣列檢測器、Waters 2707自動進樣器、Waters 038040柱溫箱、資生堂 C18色譜柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm)。

2 方法與結果

采用DNA條形碼技術及HPLC技術對巴西草藥TANCHAGEM以及中藥車前草進行檢測分析。

2．1 DNA 條形碼分析

2．1．1 DNA提取和PCR擴增 取巴西樣品，一式三份，分別用液氮冷凍后研磨成細粉，采用植物DNA提取試劑盒提取總DNA。采用ITS序列通用引物，上游 P1:5'-AGAAGTCGTAACAAGGTTTC-3';下游 P4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，在 PCR擴增儀上進行擴增。PCR擴增條件:50μL體系含2×Taq PCR MasterMix 25μL，引物 P1和 P4各加2．5 μL(5 μmol/L)，DNA 模板 4 μL，ddH2O16 μL。PCR擴增程序:94℃預變性5分鐘，94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，40個循環后，72℃延伸10分鐘。PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下檢視，產物均由上海生工生物工程有限公司測序部測序。各樣品均采用正向和反向測序，以保證測序的準確性。

圖1 TANCHAGEM的性狀圖

2．1．2 序列分析方法 利用ContigExpress軟件對測序獲得的正、反向序列進行拼接，根據NCBI中BLAST功能，檢索NCBI中注冊的相似度最高的物種，按照相似度最高的物種截取ITS全長。以相似度90%以上為屬的溯源依據，以相似度97%以上為物種溯源依據，獲得溯源結果。

2．2 特征圖譜分析

2．2．1 對照品及供試品溶液的制備 對照品溶液的制備 取大車前苷對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加60%甲醇制成每1 mL含0．1 mg的溶液，即得。取樣品粉末(60目)1 g，一式三份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30分鐘，放冷，再稱定重量，用60%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2．2．2 色譜條件 色譜柱:資生堂C18色譜柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm);流動相:乙腈 －0．1%甲酸溶液(17:83);檢測波長:330 nm;流速:1．0 mL/min;進樣量:10μL;柱溫:30℃。

2．2．3 專屬性考察 按“2．2．1”項下方法制備對照品溶液及各供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液或供試品溶液10μL，按上述色譜條件進樣分析，各色譜圖見圖2。如圖所示，測定方法專屬性好，待測成分與其它成分分離度大于1．5，且其他成分對待測成分測定無干擾。

圖2 對照品溶液及各供試品溶液的HPLC圖

2．2．4 線性關系考察 精密吸取對照品溶液1μL、5 μL、10 μL、20 μL、30 μL、40 μL，按“2．2．2”項下色譜條件進行測定，記錄峰面。以對照品的進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程:Y=1445396276687．18X － 182497．06，R2=0.9989。結果表明，大車前苷在0．1014～4．056 μg質量范圍內線性關系良好。

2．2．5 精密度考察 取大車前苷對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加60%甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，按“2．2．2”項下色譜條件進行測定，連續進樣6次，每次進樣10μL，記錄峰面積。RSD為1．10%，符合2010年版《中華人民共和國》(一部)規定，本法精密度良好。

2．2．6 穩定性考察 取中國車前草樣品，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，分別于室溫放置0、2、4、6、8、10、12 小時，在上述色譜條件下進樣分析，記錄峰面積。RSD為2．00%，符合2010年版《中華人民共和國》(一部)規定，本法穩定性良好。2．2．7 重復性考察 取中國車前草樣品，一式6份，按“2．2．1”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進樣分析，記錄峰面積，計算 RSD值。RSD為1．60%，符合2010年版《中華人民共和國》(一部)規定，表明本法重復性良好。

2．2．8 加樣回收率實驗 取6份中國車前草樣品，每份約0．5 g，精密稱定，分別精密加入一定量的大車前苷標準溶液，按“2．2．1”項下方法制備供試品溶液，按“2．2．2”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，計算回收率與RSD。結果表明大車前苷的平均回收率為105．8%，RSD為2．00%，均符合2010年版《中華人民共和國》(一部)規定，表明本法含量測定結果良好。見表1。

2．3 結果

2．3．1 DNA條形碼結果 3份巴西樣品測序結果一致，選擇一條序列用于后續分析。截取ITS片段后，經BLAST檢索，樣品與車前科車前屬植物相似度最高，相似度范圍為96～99%，因此巴西草藥TANCHAGEM來自車前科車前屬Plantago L．植物。根據DNA條形碼相似度達到99%以上的溯源指標，Plantago myosuros、Plantago australis、Plantago virginica、Plantago uniglumis、Plantago trinitatis、Plantago asiatica可能為巴西草藥TANCHAGEM的基原。見圖3～4。2．3．2 大車前苷含量測定結果 分別取巴西草藥TANCHAGEM、中藥車前草約1 g，精密稱定，一式三份，按“2．2．1”項下方法制備供試品溶液，按“2．2．2”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，計算待測成分含量，結果見表2。

表1 中國車前草中大車前苷的加樣回收率結果

圖3 巴西樣品TANCHAGEM的ITS片段圖

圖4 巴西樣品TANCHAGEM的ITS序列BLAST結果

表2 巴西草藥TANCHAGEM、中國車前草中大車前苷的含量(n=3)

巴西樣品TANCHAGEM與中藥車前草的特征性譜圖相似度極高，且兩者均含有2010年版《中華人民共和國》(一部)規定的車前草指標成分大車前苷，巴西車前草中大車前苷含量為0．1025%，中藥車前草中含量為0．1030%，兩者含量接近，均符合2010年版《中華人民共和國》(一部)規定。巴西草藥TANCHAGEM內控指標符合要求，品質優良。

3 討論

本實驗采用“二維特征鑒別法”，利用中藥DNA條形碼的遺傳學唯一特性，以及中藥指標性成分可量化的特點，對未知樣品按照先“真偽”再“優劣”的研究思路進行質量控制，該法可實現對樣品基原、指標性成分以及相應HPLC圖譜的綜合控制，相較于僅考察單一指標的傳統質控方法，“二維特征鑒別法”能更為全面的反應樣品信息。

綜上所述，巴西樣品TANCHAGEM為車前科車前屬Plantago L．植物，其HPLC圖譜與中藥車前草相似度極高，且所含大車前苷含量符合2010年版《中華人民共和國》(一部)規定。本實驗為下一步是否擴大樣本量進行采摘和研究巴西車前草提供了參考依據，同時也為巴西車前草的質量研究、藥用價值研究、是否引種巴西車前草以及擴大中藥資源和應用等方面提供了重要依據。

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