高效液相色譜法比較巴西桑葉與中國桑葉中蘆丁含量

艾則孜江·艾爾肯 田志浩 李莉 徐文英 高山山 韓麗 趙百孝劉春生 馬長華

·巴西草藥研究專題·

高效液相色譜法比較巴西桑葉與中國桑葉中蘆丁含量

艾則孜江·艾爾肯 田志浩 李莉 徐文英 高山山 韓麗 趙百孝劉春生 馬長華

目的 通過研究不同產地桑葉中蘆丁含量,為桑葉資源的開發、利用提供初步的基礎。方法 采用HPLC法分別對11份不同產地藥材樣品的蘆丁含量進行測定。高效液相色譜法條件為TechMate C18(4.6 mm×250 mm,5μm,NO.AKAD06833),以甲醇-0.5%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫,檢測波長為358 nm,柱溫為30℃。結果 8份國產樣品的蘆丁含量均未能達到《中華人民共和國藥典》(一部)(2010年版)的含量標準,3份巴西樣品高于《中華人民共和國藥典》(一部) (2010年版)要求。結論 國內桑葉中蘆丁含量普遍較低,巴西黑桑葉中蘆丁含量較高。

桑葉; 蘆丁; 含量測定

桑葉始載于《神農本草經》,為?？浦参锷orus alba L.的干燥葉,中國大部分地區均有栽培,尤以長江中下游及四川盆地為主。市場上也以此產地為主。桑葉性甘,苦寒,歸肺、肝經,具有疏散風熱,清肺潤燥,清肝明目的作用,用于風熱感冒,肺熱燥咳,頭暈頭痛,目赤昏花等癥,《神農本草經》稱其為“神仙葉”[1-2]。桑葉中的有效成分主要包括黃酮類、生物堿類、苯丙素類、有機酸類、甾體及三萜類等多種化合物[3],其中黃酮類化合物是桑葉的重要活性成分之一。新疆桑葉(Mulberry Leaves)異名鐵扇子,為?？?Moraceae)植物桑Morus alba L.的樹葉,產于新疆阿克蘇、和田和喀什等地區古老的樹種,其葉具有補血鎮靜等功效,是新疆獨一無二的特殊稀貴資源,具有很高的藥用價值?，F代藥理研究表明,桑葉具有降糖降脂[4-5]、抗氧化[6]、抗腫瘤[7]等多種活性作用。巴西擁有較豐富的桑樹資源,栽培品種主要為白桑,主要集中在巴拉那州的馬林加等北部縣。為了更好地了解目前市場上的桑葉藥材質量情況及擴大桑葉藥用資源,依照2010版《中華人民共和國藥典》(一部),筆者對巴西桑葉和中國桑葉中的蘆丁進行了含量測定。

1 材料與儀器

Waters 1525高效液相色譜儀(配置:泵Waters1525、檢測器 Waters 2998、自動進樣器2707),旋轉蒸發儀(EYEL-A,N-1001),真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司),KQ-400KDE型高功率數控超聲波清洗器(昆山舒美),水浴鍋SHW.W-600(東方精銳),SchneiderMETTLER AE 240電子分析天平,SchneiderSARTFORUIS AG BS電子分析天平;無水乙醇(分析純,北京化工廠),甲醇(色譜純Fisher),水(去離子水);巴西桑葉(馬林加、隆德里納和烏木阿拉瑪)、新疆桑葉(新疆和田市、英阿瓦提、洛普縣和墨玉縣)、同仁堂桑葉(浙江、江蘇和四川)和自采桑葉(北京中醫藥大學東校區,初霜后采集,60℃烘干),所有藥材經北京中醫藥大學劉春生教授鑒定為桑科植物桑Morus alba L.。

2 方法與結果

2.1 標準樣品溶液的制備

取蘆丁對照品適量,精密稱定,用甲醇制成每1 mL含0.Lmg的溶液,作為母液備用。

2.2 供試樣品溶液的制備

取桑葉粉末(過三號篩)約1 g,精密稱定,置圓底燒瓶中,加甲醇50 mL,加熱回流30分鐘,濾過,濾渣再用甲醇50 mL,同法提取2次,合并濾液,減壓回收溶劑,殘渣用甲醇溶解,轉移至25 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,濾過,取續濾液,即得。

2.3 色譜條件

色譜柱:TechMate C18(4.6mm×250mm,5μm, NO.AKAD06833);流動相:以甲醇為流動相A,以0.5%的磷酸溶液為流動相B,按表1進行梯度洗脫;流速:1 mL/min;檢測波長:358 nm;柱溫:24℃,見表1,色譜圖見圖1。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系 取0.10 mg/mL蘆丁標準品溶液分別進樣2μL、5μL、7.5μL、10μL、12.5μL、 20μL測定峰面積。以峰面積為縱坐標,質量為橫坐標繪制標準曲線,得蘆丁回歸方程:Y=2.0E+9X-1.3E+5,R2=0.9994。結果蘆丁在0.02 mg～0.20 mg質量范圍內線性關系良好。

2.4.2 精密度實驗 取0.10 mg/mL的蘆丁對照品溶液分別進樣6針,每針12.5μL,以峰面積為指標計算精密度,得蘆丁RSD=1.17%,表明精密度良好。

2.4.3 穩定性實驗 取樣品2.0 g,按上述工藝提取,得供試品溶液,分別在0小時、2小時、4小時、6小時、8小時、10小時進樣。以峰面積為指標計算穩定性,蘆丁RSD=1.28%,表明蘆丁在10小時內穩定性良好。

2.4.4 重復性實驗取樣品2.0 g,按上述提取工藝提取,得供試品溶液,分別進樣6針,每針10μL,以峰面積為指標計算重復性,蘆丁RSD=0.92%,表明重復性良好。

2.4.5 加樣回收率實驗 精密稱取藥材粉末6份(約1 g),加入蘆丁0.40 mg。按2010版《中華人民共和國藥典》(一部)方法操作。以峰面積為指標計算加樣回收率。蘆丁RSD=0.79%,加樣回收率平均為100.97%,表明加樣回收率良好。

2.5 樣品測定及分析

分別取巴西桑葉、新疆桑葉、同仁堂桑葉和自采桑葉,按“2.2”項下方法對藥材進行處理,按“2.3”項下的色譜條件對制得的藥材供試樣品溶液和標準樣品溶液進行測定,并分析計算供試樣品蘆丁含量。各產地樣品測定結果見表2,以蘆丁為指標巴西桑葉中蘆丁含量遠遠高于國內桑葉,且高于2010版《中華人民共和國藥典》(一部)規定,本研究收集的國內桑葉蘆丁含量均低于藥典規定的0.1%,其中國內桑葉中新疆黑桑蘆丁含量最低。見表3。

3 討論

通過本實驗結果可以發現國內市售桑葉藥材中蘆丁含量普遍偏低,并且低于2010版《中華人民共和國藥典》(一部)規定,而巴西桑葉高于2010版《中華人民共和國藥典》(一部)規定,究其原因可能是由于采收季節不同。桑葉采收季節按照傳統用藥習慣確定,以霜桑葉為最佳?！吨腥A人民共和國藥典》(一部)也規定桑葉要初霜后采收。楊普香等[9]的研究表明,9月底以后,桑葉中黃酮類化合物含量一直上升,霜后總黃酮含量,約為春夏秋桑葉的2倍,這為初霜后采收桑葉提供了科學依據。但是孟磊等[10]對新疆地區的桑葉中總黃酮含量進行測定,結果表明新疆地區的桑葉霜前(9月)總黃酮含量高于霜后,這可能與新疆地區特殊的生態環境有關。中國桑資源豐富,全國各地都有栽培,現有標準中規定的采收季節是否普遍適用,還需要做進一步的考察。單一質量控制指標不能全面地代替藥材的療效,桑葉中含有生物堿、多糖、黃酮、酚類等多種化合物,具有不同的藥理活性,用單一成分測定的方法來對藥材進行質量控制,合理性有待商榷。中藥指紋圖譜不失為一種控制中藥質量的有效方法之一。目前,英國、印度以及世界衛生組織等都采用指紋圖譜技術對植物藥、草藥質量進行評價[11]。有關桑葉指紋圖譜的研究還處于探索階段,有待進一步研究。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫藥科技出版社,2010:279.

[2] 江蘇新醫學院.中藥大辭典(下冊)[M].上海:上?？茖W技術出版社,1985:1963.

[3] 劉利,潘一樂.不同桑種桑葉總黃酮含量分析[J].農業工程科學,2008,24(1):488-491.

[4] Andallu B,Suryakantham V,Lakshmi Srikanthi B,et al.Effect ofm ulberry(Morus indica L.)therapy on plasma and erythrocyte mem-brane lipids in patientswith type 2 diabetes[J].Clin Chim Acta,2001,314(1-2):47-53.

[5] Andallu B,Varadachary ulu NCh.Control of hyperglycemia and re-tardation of cataract bym ulberry(Morus indica L.)leaves in strepto-zotocin diabetic rats[J].Indian J Exp Biol,2002,40 (7):791-795.

[6] Doi K,Kojima T,Fujimoto Y.M ulberry leaf extract inhibits the ox-idative modification of rabbit and human low density lipoprotein[J].Biol Pharm Bull,2000,23(9):1066-1071.

[7] Kim SY,Gao JJ,Kang HK.Two flavonoids from the leaves of Morusalba induce differentiation of the human promyelocytic leukemia(HL-60)cell line[J].Biol Pharm Bull,2000,23(4): 451-455.

[8] 郭小補,廖森泰,鄒宇曉,等.不同桑品種的桑葉總黃酮含量與體外抗氧化活性的相關性[J].蠶業科學,2008,34(3): 381-386.

[9] 楊普香,管幫福,黎小萍,等.桑葉中黃酮類化合物、氨基酸、桑多酚的含量變化探討[J].蠶桑茶葉通訊,2003,(112): 2-3.

[10] 孟磊,孫蓮,張麗靜,等.新疆桑葉中總黃酮含量的測定[J].中國民族民間醫藥雜志,2002,(s6):176-177.

[11] 江蔚欣,欽浩,何文順.中藥指紋圖譜研究的重要性及注意事項[J].黑龍江醫藥,2008,21(3):25-27.

Comparison of rutin between Brazilian and Chinesemulberry leaf by HPLC

Aizezijiang Ai-er-ken,TIAN Zhi-hao,LILi,et al. School of Chinese Materia Medica,Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102,China

MAChang-hua,E-mail:machanghua60@sina.com

Objective Decete the content of rutin in mulberry leaves from different origins by HPLC and analyze the discrepancy for the development and utilization of mulberry leaves provide a preliminary basis.M ethods 11 kinds of mulberry leaves samples from domestic and foreign were detected.HPLC conditions,C18TechMate(4.6 mm×250mm,5μm,NO.AKAD06833)was used for detection.The gradient elution was carried out with methanol-0.5%phosphoric acid solution as mobile phase,the detection wavelength was358 nm,and the column temperaturewas30℃.Results The content of rutin in 8 kinds of domestic sampleswas failed to achieve the standard of Chinese Pharmacopoeia(2010 edition),the Brazilian samples were higher than the requirements of pharmacopoeia.Conclusion The content of rutin in domesticmulberry leaves is lower than that in Brazilianmulberry leaves,and the content in the Brazil black mulberry leaves is themost

Mulberry leaves; Rutin; Content determination

R284

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.11.001

2015-08-22)

(本文編輯:董歷華)

國家國際科技合作專項(2011DFA31370)

100102 北京中醫藥大學中藥學院(田志浩(博士研究生)、李莉(碩士研究生)、徐文英(碩士研究生)、高山山(碩士研究生)、劉春生、馬長華),針灸推拿學院(趙百孝),中醫養生研究所(韓麗);新疆醫科大學第一附屬醫院藥學部(艾則孜江·艾爾肯)

艾則孜江·艾爾肯(1986-),碩士。研究方向:藥品質量控制。E-mail:aizi1009@sina.com

馬長華(1960-),本科,教授,碩士生導師。研究方向:藥品質量控制。E-mail:machanghua60@sina.com