沉默miR156表達的mimicry156載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化煙草的研究

馮圣軍　章玉婷　繆家順　詹妮　朱祝軍　于超　王華森

摘要：miR156在植物營養(yǎng)生長階段幼年期向成年期的轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，其通過降解SPLs基因mRNA和翻譯抑制調(diào)控靶基因的表達。通過定向改造擬南芥內(nèi)源性Target mimicry IPS1（INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1）構(gòu)建了抑制miR156表達的mimicry156載體，并轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株，轉(zhuǎn)基因植株mimicry156對內(nèi)源性miR156具有抑制作用。該方法為研究miR156在植物營養(yǎng)生長階段的調(diào)控作用提供了方便有效的途徑。

關(guān)鍵詞：miR156；Target mimicry IPS1；表達載體；轉(zhuǎn)化

中圖分類號：Q785 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）01-0210-05

miRNA是真核生物中非編碼的小RNA，在基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用，一般位于編碼蛋白質(zhì)的基因之間，在高等植物編碼蛋白質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中存在莖環(huán)（Stem-Loop）結(jié)構(gòu)，經(jīng)過一系列復(fù)雜的加工后，Dicer-Like（DCL）家族基因?qū)⑶o環(huán)結(jié)構(gòu)中大約21個核苷酸大小的成熟miRNA單鏈切割出來，其可以選擇性地裝載到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）上，miRNA與靶標RNA進行互補配對，造成靶標RNA的降解或翻譯抑制[1]，因而能在轉(zhuǎn)錄后水平專一性調(diào)控靶基因的表達。通常miRNA與其靶基因之間的表達呈負相關(guān)，即在組織水平上某個miRNA含量的增加往往伴隨著其靶基因轉(zhuǎn)錄水平的下降，與轉(zhuǎn)錄抑制因子相比，miRNA能在轉(zhuǎn)錄后水平更迅速地調(diào)節(jié)靶蛋白質(zhì)含量，顯著縮短調(diào)控反應(yīng)的延滯期，精確維持靶蛋白質(zhì)的穩(wěn)定狀態(tài)，從而有效地調(diào)控植物的生長發(fā)育[2]、生物及非生物的脅迫響應(yīng)[3]。

miR156在植物營養(yǎng)生長階段幼年期向成年期轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，其在擬南芥（Arabidopsis thaliana）[4]，玉米（Zea mays）[5]，苔蘚（Physcomitrella patens）[6]、番茄（Lycopersicon esculentum）[7]，夏堇（Torenia fournieri）[8]、軟枝草（Panicum virgatum L.）[9]、水稻（Oryza sativa）[10]等植物中都被證明是營養(yǎng)期轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵調(diào)控因子。miR156通過降解SPLs基因mRNA并通過翻譯抑制調(diào)控靶基因表達，miR156的表達豐度隨著植物發(fā)育進程逐漸降低的同時，解除了對SPLs基因的抑制從而順利調(diào)控植物幼年向成年的過渡。

miR156等microRNA在植物中的重要調(diào)節(jié)作用已成為近年來研究的熱點。正向遺傳學(xué)研究法通過誘變劑處理，大量篩選突變體研究其表型和生理代謝。但是這種方法隨機性較大，不易獲得目的miRNA功能缺失的突變體，給研究帶來了較大的障礙。靶基因模擬（Target mimicry，TM）技術(shù)的出現(xiàn)提供了一種新穎的miRNA研究方法。

植物中磷的生理平衡受復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)支配，從而有效地控制植物的生長[11]。研究發(fā)現(xiàn)miR399、PHO2和IPS1形成反饋循環(huán)系統(tǒng)調(diào)節(jié)植物中磷的動態(tài)平衡。在缺磷脅迫下miR399誘導(dǎo)降解與其具有一段互補區(qū)域的PHO2 mRNA，PHO2能夠編碼一種E2泛素結(jié)合酶，而這種酶影響植物中磷的含量和再利用過程[12]。除了PHO2 mRNA能夠與miR399互補結(jié)合外，研究發(fā)現(xiàn)TPSI基因家族的mRNA同樣含有miR399的結(jié)合域，IPS1（INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1）屬于TPSI家族的一員，但與miR399互補配對的IPS1不僅沒有降解反而具有抑制miR399活動的效果[12]。與miR399調(diào)節(jié)PHO2的靶位點相比，IPS1在結(jié)合域的中心位點有3個核苷酸的插入，相當于miRNA調(diào)節(jié)靶基因結(jié)合區(qū)域的突起部分，從而阻止了miR399-RISC復(fù)合體對IPS1的切割，同時IPS1占據(jù)miR399，從而抑制其對靶基因的降解作用[13]。研究發(fā)現(xiàn)，IPS1作用原理同樣可用于抑制其他miRNA的活動[13]，本研究通過定向改造擬南芥內(nèi)源性IPS1構(gòu)建抑制miR156表達的mimicry156載體，旨在為進一步研究miR156在植物營養(yǎng)階段的調(diào)控作用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 擬南芥（Arabidopsis thaliana）哥倫比亞生態(tài)型（Col-0），煙草（Nicotiana tabacum）（NC89）均為浙江農(nóng)林大學(xué)蔬菜品質(zhì)改良重點實驗室保存。

1.1.2 細菌菌株與質(zhì)粒載體 根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌種GV3101，由pCambia3300改造的具有pUbi10 啟動子的pSY06表達載體，均為本實驗室保存。大腸桿菌（E.coli）菌種Trans5α Chemically Competent Cell，克隆載體 pEASY？誖-Blunt Cloning Kit均購自全式金生物技術(shù)有限公司（北京）。

1.1.3 酶及生化試劑 卡那霉素（Kan）、慶大霉素（Gen）、羧芐青霉素（Carb）和草甘膦（PPT）均購自Sigma 公司。高保真DNA 聚合酶PhusionTM High-Fidelity DNA Polymerase購自于美國NEB（NEW ENGLAND BIOLADS）公司。限制性內(nèi)切酶SpeⅠ/BamHⅠ、T4 DNA 連接酶及反轉(zhuǎn)錄試劑盒、定量PCR試劑盒均為Takara公司（大連）產(chǎn)品。質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒購自生工生物工程股份有限公司（上海）。總RNA 提取試劑盒Trizol購自Invitrogen公司，引物合成、測序由華大基因有限公司完成。endprint

1.2 方法

1.2.1 擬南芥IPS1基因克隆 以缺磷培養(yǎng)的擬南芥（Col-0）為材料，依據(jù)Trizol試劑盒說明書進行總RNA 的提取，并進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)IPS1的全長cDNA 序列，利用Primer Premier 5.0 引物設(shè)計軟件在編碼區(qū)兩端分別設(shè)計擴增引物P1（5′-GGACTAGTATGGGGAGACAACCATGCTG-3′）和P2（5′-CGCGGATCCTCAAAACAACCCAAAAGTGG-3′）。P1引物的5′端加入 BamHⅠ酶切位點，P2引物5′端加入 SpeⅠ酶切位點，以擬南芥cDNA為模板，PCR 擴增IPS1基因。PCR 反應(yīng)條件為94 ℃ 3 min， 94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。將獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的條帶，用膠回收試劑盒回收備用。

1.2.2 定向改造IPS1基因 定向改造IPS1基因，通過重疊PCR獲得mimicry156目的片段。將IPS1上與miR399 結(jié)合的區(qū)域，通過設(shè)計特定引物P3（5′-CTTTGACAGAAGATAGAAGTGAGCATTTTCTA

GAGGGAGATAA-3′）和P4（5′-AAATGCTCACTTCT

A TCTTCTGTCAAGCTTCGGTTCCCCTCG-3′），改造為miR156與其靶基因結(jié)合區(qū)域，通過融合PCR的方法，以上述克隆到的IPS1基因為模板，分別以P1、P3和P4、P2作為引物分段擴增，得到2個克隆片段。然后用這2個片段為模板，以P1和P2為引物，通過融合PCR擴增，產(chǎn)物即為改造好的mimicry 156片段。擴增PCR 反應(yīng)條件為94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 35 個循環(huán)；72 ℃ 7 min。融合PCR 反應(yīng)條件為94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 7 min。將獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的條帶，用膠回收試劑盒回收。

1.2.3 mimicry156載體的構(gòu)建 將上述回收得到的目的片段進行定向連接，連接到克隆載體pEASY？誖-Blunt Cloning Kit上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌Trans5α，菌液經(jīng)PCR和測序驗證。提取陽性克隆質(zhì)粒經(jīng)SpeⅠ和BamHⅠ雙酶切后，回收目的片段連入pSY06表達載體中，通過菌液PCR與SpeⅠ和BamHⅠ雙酶切驗證后，采用凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，-80 ℃保存菌株。

1.2.4 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化與鑒定 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草NC89[14]，通過50 mg/L PPT篩選轉(zhuǎn)基因抗性植株，并提取T0代煙草轉(zhuǎn)基因株系進行基因組PCR 鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 定向改造IPS1為mimicry156

Target mimicry通過隔絕miRNA來調(diào)控miRNA對靶基因的降解活動，這種作用機制為miRNA的功能研究提供了異于傳統(tǒng)遺傳學(xué)且方便有效的途徑。IPS1作為典型的內(nèi)源性Target mimicry，在缺磷脅迫下與miR399共同維持植物體內(nèi)磷代謝平衡。根據(jù)這種機制本試驗將IPS1定向改造為抑制miR156表達的沉默載體。以缺磷培養(yǎng)的擬南芥cDNA為模板，通過PCR擴增出IPS1基因全長。通過設(shè)計特異性引物P3、P4，將IPS1與miR399的結(jié)合區(qū)域改造為miR156與其靶基因互補的區(qū)域（圖1），利用重疊延伸的方法，以IPS1的編碼序列為模板進行分段擴增（引物分別為P1、P3和P2、P4）。將2種PCR產(chǎn)物回收并作為模板，以P1和P2為引物進行融合PCR擴增，產(chǎn)物即為mimicry156，圖2為重疊PCR的具體流程示意圖。

2.2 植物表達載體的構(gòu)建

mimicry156片段與pEASY？誖-Blunt Cloning Kit載體連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Trans5α后，如圖3A菌液PCR電泳結(jié)果所示，已篩選到了陽性轉(zhuǎn)化子。測序結(jié)果進一步表明，陽性克隆的序列與設(shè)計的序列保持一致。用限制性內(nèi)切酶SpeⅠ和BamHⅠ將質(zhì)粒和pSY06進行雙酶切，經(jīng)回收后將目的基因片段插入表達載體pSY06、pUBQ10啟動子的下游，構(gòu)成mimicry156載體，將構(gòu)建好的載體分別用SpeⅠ和BamHⅠ雙酶切（圖3B）并進行測序驗證，結(jié)果證明mimicry156載體已構(gòu)建成功。圖3C結(jié)果表明，含mimicry156片段的pSY06植物表達載體已成功轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中。

2.3 煙草轉(zhuǎn)mimicry156植株的鑒定

將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草，獲得轉(zhuǎn)基因植株，圖4為煙草的遺傳轉(zhuǎn)化過程。

為了檢測轉(zhuǎn)基因是否成功，以野生型和表現(xiàn)出除草劑（Basta）抗性的轉(zhuǎn)基因煙草植株的基因組DNA為模板，通過bar基因和mimicry156序列設(shè)計的特異性引物barF（5′-GCGGTCTGCACCATCGTCAA-3′）、barR（5′-AAACCCACGTCATGCCAGTTCC-3′）和mimiF（5′-TCATGTAAGGAAAGCGTTTTAA-3′）、mimiR（5′-ACTGGTCTGACTATTCTCCAAA-3′）分別進行PCR擴增，鑒定轉(zhuǎn)基因植株。從圖5中可以看出，轉(zhuǎn)基因植株基因組中擴增出bar基因和mimicry156片段，而野生型植株中沒有擴增出相應(yīng)片段，初步判定目的基因已整合到煙草的染色體上。

2.4 轉(zhuǎn)基因煙草表型分析

將上述PCR檢測獲得的8株T0代陽性植株中的9號和34號株系T1代種子和野生型煙草種子播種于無菌土中，經(jīng)4 ℃破休眠48 h后移入溫室中，此時開始計算植株年齡，待小苗長出子葉后噴施Basta，篩選自交分離含T-DNA的植株，真葉長出后轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株表型逐漸表現(xiàn)出不同（圖6A）。mimicry156植株表現(xiàn)出快速成熟的表型（圖6B）：開花明顯提前（圖6C），葉片數(shù)量低于野生型植株（圖6D）。相同時間內(nèi)mimicry156超表達植株葉片發(fā)生速率明顯低于野生型煙草（圖6E）。endprint

3 討論

miR156及其靶基因SPLs控制的營養(yǎng)生長階段轉(zhuǎn)變，被證明與植物一些重要的經(jīng)濟性狀調(diào)控相關(guān)，如參與控制植物葉形、葉片大小、葉片發(fā)生速率、葉片擴展率、莖直徑、不定根的發(fā)生、側(cè)分支的形成、開花時間、花絮結(jié)構(gòu)等。擬南芥超表達miR156可使幼年蓮座葉數(shù)目顯著增多，從而有效增加生物量，為生物能源開發(fā)提供了參考；對園藝作物番茄與觀賞花卉夏堇的研究發(fā)現(xiàn)，miR156對作物株型的修整和果實形狀大小的改變發(fā)揮重要的作用[7，8]；能源植物軟枝草過表達miR156顯著提高了葉片數(shù)量，為燃料的生產(chǎn)提供資源，同時針對性地表達miR156可提高可溶性糖的含量[9]。研究發(fā)現(xiàn)，miR156在植物多種營養(yǎng)物質(zhì)合成路徑中發(fā)揮重要的作用，Gou等[15]研究證實miR156活動的增加提高了擬南芥花青素的含量，揭示了花青素、黃酮等次生代謝產(chǎn)物受到miR156-SPLs的調(diào)節(jié)。新近研究發(fā)現(xiàn)，光合作用的主要產(chǎn)物—糖，能夠作為一個可移動的信號分子抑制新生葉原基中miR156的表達，從而促進營養(yǎng)生長階段轉(zhuǎn)變的發(fā)生[16-18]。因此，研究miR156-SPLs在植物中的調(diào)控機制具有重要意義。

傳統(tǒng)的遺傳方法研究miRNA具有很大的局限性，Target mimicry的出現(xiàn)提供了一種全新的調(diào)節(jié)特定內(nèi)源性miRNA表達量的方法。本試驗通過RT-PCR方法克隆了擬南芥IPS1基因，同時定向改造為具有miR156結(jié)合位點的抑制miR156表達的mimicry156。為了進一步研究其對miR156的調(diào)節(jié)功能，構(gòu)建了啟動子mimicry156植物表達載體，并將其轉(zhuǎn)化到煙草中。轉(zhuǎn)基因植株基因組PCR和Basta檢測表明，mimicry156已經(jīng)整合到煙草染色體中，轉(zhuǎn)基因后代與野生型對照相比，其葉片發(fā)生率降低，開花提前，表現(xiàn)出早熟的性狀。上述結(jié)果表明，Target mimicry為miR156在植物間保守的調(diào)控功能提供了新穎的研究方法，為未來的研究奠定了基礎(chǔ)。

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