蔬菜類植物組織培養(yǎng)過程中的褐變問題及控制措施

鄒甜 ，李涵 ，閔子揚(yáng) ，成娟 ，童龍 ，王志偉 ，孫小武 ，2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，長沙，410128；2.湖南省瓜類研究所）

褐變是指外植體在組培過程中胞內(nèi)的酚類物質(zhì)被氧化成醌類物質(zhì)，從表面向外釋放褐色物質(zhì)，使培養(yǎng)基變成褐色，影響脫分化和再分化，導(dǎo)致外植體最終死亡的現(xiàn)象。褐變在組培過程中普遍存在，它與菌類污染和玻璃化現(xiàn)象是組培過程中的三大難題，能否有效控制褐變是決定組培試驗(yàn)是否成功的關(guān)鍵。組培技術(shù)在國內(nèi)外發(fā)展迅速，對褐變的研究也較多，本文綜述了蔬菜方面關(guān)于褐變的最新研究進(jìn)展，闡述了褐變發(fā)生的原因及有效控制褐變的方法。

1 褐變原因

1.1 非酶促褐變

非酶促褐變不涉及酚類物質(zhì)的產(chǎn)生，指細(xì)胞壞死（細(xì)胞自然死亡或外界因素造成的程序化死亡等）而產(chǎn)生的褐變現(xiàn)象。

1.2 酶促褐變

目前認(rèn)為酶促反應(yīng)是褐變的主要原因。外植體褐變與其體內(nèi)的酚類物質(zhì)含量及多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，簡稱 PPO）活性密切相關(guān)，酚類物質(zhì)含量高的品種更易發(fā)生褐變[1]。而許多植物特別是木本植物中的酚類物質(zhì)含量非常高。正常條件下，植物組織因細(xì)胞膜的分隔作用或多酚氧化酶未被激活，不易發(fā)生褐變[2]。當(dāng)植物組織受傷后，細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，其體內(nèi)會發(fā)生一系列的生理變化，最終導(dǎo)致褐變。而在植物組培過程中，外植體被切開時打破了酚和酶的分布，酚類物質(zhì)在有氧條件下被迅速氧化成褐色的醌類物質(zhì)，并逐漸擴(kuò)散到培養(yǎng)基，同時抑制其他酶的活性，最終導(dǎo)致組織壞死[3]。

2 影響褐變的因素

2.1 外植體

①外植體基因型 一般來說，單寧類化合物和羥酚類化合物含量高的外植體材料更容易發(fā)生褐變。李佳等[4]用組織學(xué)切片方法觀察發(fā)現(xiàn)，單寧類物質(zhì)是導(dǎo)致蓮藕愈傷組織褐變的重要因素之一。Mayer等[5]和Kahn[6]的研究均表明，在組織培養(yǎng)過程中褐變與酚類物質(zhì)含量密切相關(guān)，酚類物質(zhì)含量越高越容易發(fā)生褐變。呂穎穎等[7]以8個不同基因型的玉米自交系為材料，在相同條件下培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)其愈傷組織褐變情況有很大差異。

②外植體年齡 通常取幼齡部位進(jìn)行組織培養(yǎng)不易褐變，但隨著組織的老齡化，植物組織內(nèi)醌類物質(zhì)增多而褐變嚴(yán)重。幼胚胚齡是決定胚性愈傷組織褐化程度的重要因素之一。宋欽虎等[8]研究了胚齡對玉米愈傷組織誘導(dǎo)中褐化情況的影響，發(fā)現(xiàn)同一自交系的不同胚齡的幼胚褐變程度明顯不一樣。李海燕等[9]將大豆子葉、胚尖和下胚軸在同一條件下培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)較幼小胚尖的褐化率最低。

③外植體取材時間和生理狀態(tài) 一般在春夏季特別是春季取材的褐變情況較輕，外植體生長旺盛，分生能力強(qiáng)且不易褐變，而以已經(jīng)木栓化或木質(zhì)化的枝條和處于休眠狀態(tài)的芽作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)時則褐變嚴(yán)重，這種現(xiàn)象是由于分生部位接種后形成醌類物質(zhì)較少，而分化部位形成的醌類物質(zhì)較多導(dǎo)致的。另外值得注意的是，有報道稱生長在陰處的外植體比生長在陽光下的外植體褐變率低[10]，而李然紅等[11]在取外植體前對母株進(jìn)行遮光處理，降低了甘藍(lán)愈傷組織褐變率證實(shí)了這一觀點(diǎn)。

④外植體受傷程度 外植體受傷程度較小時褐變更易控制，所以平常取材時應(yīng)盡量減少傷口面，保持材料的完整性。Bonga等[12]曾報道，外植體越小，其傷口面與體積的比就越大，越容易發(fā)生褐變；Reuveni等[13]取完整的胚和葉片進(jìn)行培養(yǎng)時褐變率小于不完整胚和葉片的。另外，除取材時的機(jī)械損傷外，消毒處理也會使外植體受到一定的傷害。庾韋花等[14]對牛尾菜褐變的研究表明，外植體的褐變率隨升汞處理時間的延長呈上升趨勢。

2.2 培養(yǎng)基

①鹽離子濃度 培養(yǎng)基中的鹽離子是外植體生長所必需的，但是鹽離子濃度過高卻容易促發(fā)褐變。有報道稱，在低鹽濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)牛尾菜時其褐變程度得到了改善，褐變時間有所推遲[14]。許傳俊等[15]研究也發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基中的Fe含量增加會導(dǎo)致褐變加重。李然紅等[11]將1/2 MS和MS兩種培養(yǎng)基對褐變的影響進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)以MS培養(yǎng)基培養(yǎng)的甘藍(lán)愈傷組織褐變程度較為嚴(yán)重，這與MS培養(yǎng)基中鹽離子濃度較高有關(guān)。

②激素種類和濃度 蔣燕等[16]的試驗(yàn)表明，6-BA會影響辣椒子葉愈傷組織褐變的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，與添加6-BA相比，添加TDZ的基礎(chǔ)培養(yǎng)基更有利于減輕蝴蝶蘭外植體的褐變[17]。康德賢等[18]在進(jìn)行辣椒不育系子葉愈傷組織誘導(dǎo)時也發(fā)現(xiàn)，添加1.0 mg/L 2，4-D相比同濃度的6-BA更有利于減輕褐化。呂穎穎等[7]卻發(fā)現(xiàn)2，4-D使用濃度過大（>3 mg/L）時，玉米愈傷組織褐變率會明顯升高。

③其他 蔗糖一般被認(rèn)為是植物組織培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)碳源，呂穎穎等[7]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，蔗糖濃度在一定程度上影響褐變程度，且隨外植體基因型不同有所差異。適當(dāng)降低pH值，可抑制外植體內(nèi)多酚氧化酶（PPO）活性，控制褐變發(fā)生[19]。在pH值較低，大約為5.5時有利于減輕辣椒外植體的褐變程度[20]。

2.3 培養(yǎng)條件

①光照條件 許多研究表明，暗培養(yǎng)能明顯降低外植體的褐變率，因?yàn)楣庹漳芴岣哌^氧化物酶的活性，從而增大褐變程度。但還需注意的是暗培養(yǎng)時間過長不利于外植體的生長，應(yīng)根據(jù)具體情況和試驗(yàn)分析找到暗培養(yǎng)的最佳時間。在玉米成熟胚誘導(dǎo)時發(fā)現(xiàn)，暗培養(yǎng)可以顯著減輕褐變的發(fā)生，但要有效控制褐變還應(yīng)該結(jié)合其他的方法[20]。李樹麗[21]以中華紅葉楊莖段為外植體，研究了光照條件對褐變的影響，結(jié)果表明，培養(yǎng)初期進(jìn)行暗培養(yǎng)能有效降低褐變率，以暗培養(yǎng)10 d為宜，而光照強(qiáng)度1 000～3 000 lx對褐變率的影響不大；許傳俊等[15]的試驗(yàn)也表明，光照強(qiáng)度增加會導(dǎo)致外植體褐變加劇。

②培養(yǎng)溫度 李樹麗[21]的研究表明，溫度對褐變也有影響，在一定范圍內(nèi)褐變程度與溫度呈正相關(guān)，即一定范圍內(nèi)，隨溫度升高各種酶的活性增強(qiáng)，促進(jìn)了褐變。雷攀登等[22]也曾報道，溫度是影響茶樹腋芽褐變程度的重要因素，低起始培養(yǎng)溫度可有效減輕褐變。

③培養(yǎng)方式 一般認(rèn)為，用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)可有效減輕褐變，以濾紙輔助效果更好。因?yàn)橐后w培養(yǎng)有利于外溢的酚類物質(zhì)擴(kuò)散，從而減少了褐變的發(fā)生，而濾紙對有毒物質(zhì)有一定的吸附作用。從幾種培養(yǎng)方式的褐變控制情況進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，紙橋培養(yǎng)最好，液體培養(yǎng)基次之，固體培養(yǎng)基最不利于控制褐變，許傳俊等[15]證實(shí)了這一觀點(diǎn)。但進(jìn)一步研究時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基幾乎呈液體狀態(tài)時紅掌外植體最易褐變，愈傷誘導(dǎo)率最低。在一定范圍內(nèi)，隨培養(yǎng)基硬度增大褐變程度得到了緩解，當(dāng)硬度增大到一定程度時褐變率又上升。分析認(rèn)為，培養(yǎng)基硬度增大控制了酚類物質(zhì)的外溢，且硬度過大時有毒物質(zhì)不易擴(kuò)散，造成局部積累，從而加劇了褐變程度[23]。

3 控制褐變的方法

3.1 選擇適宜的外植體

一般應(yīng)選擇生長旺盛的組織或器官，外植體接種時也可以選擇剝?nèi)[片和大葉片，以切取幼嫩莖尖或頂芽分生組織接種較為理想。林麗媛等[24]以山雞椒葉片和莖段為材料，在相同條件下誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)現(xiàn)莖段培養(yǎng)不易發(fā)生褐變。夏銘等[25]的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，處于旺盛生長季節(jié)的幼嫩莖段是優(yōu)良的外植體，其愈傷組織發(fā)生率高、增殖快、褐變程度輕。

3.2 對材料進(jìn)行預(yù)處理

①熱激處理 最新的植物褐變研究發(fā)現(xiàn)，適度的熱激處理可以降低組織褐變程度。趙瀅等[26]研究了熱激處理對蝴蝶蘭葉片外植體組織培養(yǎng)褐變程度、外植體內(nèi)酚類物質(zhì)及活性氧代謝相關(guān)生理指標(biāo)的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)熱激處理后外植體組織培養(yǎng)褐變程度明顯減輕，總酚含量、苯丙氨酸解氨酶（PAL）及多酚氧化酶（PPO）活性降低，但對過氧化物酶（POD）活性的抑制效果不明顯，說明熱激處理通過降低PAL及PPO活性，抑制了酚類物質(zhì)的合成及氧化，且熱激處理在短時間內(nèi)提高了超氧化物歧化酶（SOD）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）的活性，進(jìn)而減少丙二醛（MDA）和過氧化氫（H2O2）的產(chǎn)生，保護(hù)了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，最終有效抑制褐變發(fā)生。

②低溫或黑暗條件下預(yù)培養(yǎng) 初期進(jìn)行暗培養(yǎng)（2周左右）可在一定程度上減輕褐變程度[25]；王小娟等[27]研究了不同光照條件對魚腥草外植體褐化程度的影響，發(fā)現(xiàn)全日照時外植體極易褐變，培養(yǎng)初期暗培養(yǎng)可以有效降低褐變率。

3.3 選擇最佳培養(yǎng)基

張桂芳等[28]對佛手組培中褐變控制方法的探討發(fā)現(xiàn)，適宜的培養(yǎng)基組分和抗褐變劑能明顯減輕佛手組織培養(yǎng)中的褐變，提高組織培養(yǎng)成功率，初步建立了佛手組織培養(yǎng)體系；夏銘等[25]的試驗(yàn)表明，適宜的培養(yǎng)基（MS+ZT 0.5 mg/L+NAA 10.0 mg/L+GA32.0 mg/L+2%蔗糖）對減輕褐變是很有利的。

3.4 添加抗氧化劑和吸附劑

在培養(yǎng)基中添加抗氧化劑和吸附劑等抗褐變劑是組織培養(yǎng)中較常用的控制褐變的方法，前者抑制多酚氧化，后者吸附氧化物，從而減輕對組織培養(yǎng)物的毒害。常見的抗氧化劑和吸附劑有抗壞血酸（VC）、硝酸銀、檸檬酸、硫代硫酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、活性炭（AC）等。

王蕾等[29]在建立番茄離體再生體系時發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽時，在培養(yǎng)基中添加0.2 g/L或0.6 g/L AC或10 mg/L VC可有效減輕褐化；林麗媛等[24]在誘導(dǎo)山雞椒愈傷組織時也發(fā)現(xiàn)添加適宜濃度的VC可以減輕褐變，且效果比AgNO3、AC、PVP都要好。康德賢等[18]發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加AC、VC、PVP時防褐變效果依次增強(qiáng)。L-半胱氨酸和AgNO3可明顯減輕大豆外植體的褐化[9]。韓美麗等[30]以木薯試管苗的頂端葉片為材料進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在繼代培養(yǎng)基中添加PVP在減小褐變率的同時可以提高愈傷組織的增殖率。Qu等[31]研究表明，用抗褐化劑溶液直接浸泡外植體，也可有效抑制褐變。

3.5 其他

通過連續(xù)轉(zhuǎn)移外植體至新鮮培養(yǎng)基和加金屬螯合劑也可減輕褐變，連續(xù)轉(zhuǎn)移減輕了醌類物質(zhì)對外植體的毒害作用，在一定程度上控制了褐變[32，33]。研究表明，PPO是一種含銅類蛋白質(zhì)，而金屬螯合劑可以和Cu2+螯合，使氧化酶失活，從而減輕褐變。夏銘等[25]證實(shí)，金屬螯合劑對褐變有抑制作用。

4 結(jié)語

在具體試驗(yàn)研究中，因外植體基因型、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)目的的不同，采用的防褐變措施、效果也不同，應(yīng)借鑒前人經(jīng)驗(yàn)摸索適合的防褐變方法，而且還要注意到各措施的局限性，例如不同植物所適宜的抗氧化劑和吸附劑的種類和濃度有很大差異；活性炭可以有效吸收培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)，但是它的吸收沒有選擇性，若吸收了培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，則不利于愈傷組織的分化；抗氧化劑的加入會增加污染率；連續(xù)轉(zhuǎn)移不利于愈傷組織的分化和生長；金屬螯合物在使多酚氧化酶失活的同時也螯合了部分 Ca2+、Mg2+、Zn2+，影響其他有利酶的活性；熱激處理對組織的活力有較大的損傷[25]；初期暗培養(yǎng)可以降低褐化率，但是暗培養(yǎng)時間不宜過長，以7 d為最佳，否則愈傷組織呈現(xiàn)灰白化[29]。所以，在實(shí)際應(yīng)用中我們應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)的實(shí)際情況選擇不同的方法，或者以多種方法相輔助，提高蔬菜愈傷組織誘導(dǎo)率和組織培養(yǎng)成功率。

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