銅綠假單胞菌耐藥基因分析及多位點序列遺傳分型

袁 夢，袁月明，陳宏彬，羅錦雁，俞慕華，段永翔

銅綠假單胞菌耐藥基因分析及多位點序列遺傳分型

袁 夢，袁月明，陳宏彬，羅錦雁，俞慕華，段永翔

目的 了解2011-2012年深圳市南山區(qū)醫(yī)院病人，各醫(yī)院、診所內(nèi)環(huán)境臺面涂抹樣、醫(yī)護(hù)人員手涂抹樣分離的銅綠假單胞菌，抗生素耐藥基因分布及基因的遺傳多樣性。方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測銅綠假單胞菌的20種耐藥基因：TEM、VEB、CARB、OXA、SHV、PER、GES、GTX、SPM、GIM、IMP、VIM、DHA、oprD、Aac(6′)-Ⅰ、Aac(6′)-Ⅱ、Aac(3′)-Ⅰ、Aac(2″)-Ⅰ、qacE1-sull及Ⅰ類整合子基因。采用多位點序列分子分型方法進(jìn)行聚類和克隆分析。結(jié)果 檢出11種耐藥基因：TEM、SHV、IMP、DHA、Aac(6’)-Ⅰ、Aac(6′)-Ⅱ、Aac(3′)-Ⅰ、Aac(2″)-Ⅰ、qacE1-sull、Ⅰ類整合子及oprD基因，檢出率分別為8.1%、6.4%、4.8%、9.7%、4.8%、14.5%、4.8%、56.5%，8.1%，8.1%，oprD基因缺失率為61.2%。52株銅綠假單胞菌檢出耐藥基因，形成19種耐藥基因譜。多位點序列分型方法將62株銅綠假單胞菌，分為39個ST型，5個克隆群，1個優(yōu)勢克隆群CC244，1個優(yōu)勢獨特型ST856。結(jié)論 不同類型樣本分離菌株攜帶耐藥基因存在差異，部分病人分離株攜帶多種耐藥基因。本研究銅綠假單胞菌具有遺傳多樣性，存在優(yōu)勢克隆群。

銅綠假單胞菌；多重耐藥；耐藥基因；聚合酶鏈反應(yīng)；多位點序列分子分型；克隆群

Supported by Shenzhen Science and Technology Plan Project (No. 201103296)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)為革蘭氏陰性桿菌，廣泛存在于各類環(huán)境中。近年來，PA已成為醫(yī)院感染最主要的條件致病菌，占世界范圍內(nèi)院內(nèi)感染細(xì)菌的10%～15%[1]且耐藥性逐年增加，多重耐藥株不斷出現(xiàn)[2]。PA的多重耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，本研究選擇20種抗生素耐藥基因，分別是β-內(nèi)酰胺TEM、VEB、CARB、OXA、SHV、PER、GES、GTX、SPM、GIM，金屬β-內(nèi)酰胺酶IMP、VIM，AmpC酶DHA，膜通道蛋白o(hù)prD，氨基糖苷類修飾酶Aac(6′)-Ⅰ、Aac(6′)-Ⅱ、Aac(3′)-Ⅰ、Aac(2″)-Ⅰ，耐消毒基因qacE1-sull與Ⅰ類整合子基因，了解耐藥基因攜帶情況。多位點序列分子分型(Multilocus Sequencing Typing，MLST)是一種通過直接測定多個管家基因的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌變異的分型方法[3]，由于可以準(zhǔn)確記錄細(xì)菌基因水平上的變異，并且序列可通過互聯(lián)網(wǎng)方便傳遞，故MLST被用于研究細(xì)菌的流行病學(xué)、致病性和進(jìn)化學(xué)[4]。本研究采用MLST分型方法對62株菌進(jìn)行分子分型，擴(kuò)增菌株7個管家基因acsA、aroE、guaA、mutL、nuoD、ppsA、trpE，聚合酶鏈反應(yīng)(polymeras chain reaction，PCR)產(chǎn)物測序，測序結(jié)果上傳數(shù)據(jù)庫比對，了解南山PA菌的基因多態(tài)性分布，優(yōu)勢克隆群，病人與環(huán)境PA株之間是否具有同源性，建立分子分型數(shù)據(jù)庫，為疾病耐藥監(jiān)測以及溯源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 分離2011-2012年南山區(qū)醫(yī)院病人、環(huán)境臺面及醫(yī)護(hù)人員雙手涂抹樣，共62株P(guān)A，其中37株分離自院內(nèi)病人；25株分離自環(huán)境樣及醫(yī)護(hù)人員涂抹樣。

1.1.2 主要儀器和試劑 基因擴(kuò)增儀(英國Barloworl公司)；電泳儀(美國Major Science公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。PCR相關(guān)試劑(大連寶生物工程有限公司)；PCR產(chǎn)物測序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離鑒定 按照《消毒技術(shù)規(guī)范》(2002年版)進(jìn)行PA菌株的分離培養(yǎng)。

1.2.2 DNA模板制備 從營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)平皿上挑取單菌落，溶于100 μL純水中煮沸5 min，冰浴5 min后，以12 000 r/min離心5 min，取上清即為提取的DNA。

1.2.3 引物 耐藥基因(TEM，SHV，OXA，PER，VEB，GES，CARB，IMP，VIM，GTX，SPM，GIM，DHA，oprD，Aac(6′)-Ⅰ，Aac(6′)-Ⅱ，Aac(3′)-Ⅰ，Aac(2′′)-Ⅱ，qacE1-sull，Ⅰ類整合子)引物及MLST7個管家基因(acsA、aroE、guaA、mutL、nuoD、ppsA、trpE)引物序列見相關(guān)文獻(xiàn)[5-7]，由上海生物工程有限公司合成。

1.2.4 PCR體系和反應(yīng)條件

1.2.4.1 耐藥基因檢測擴(kuò)增體系 10×PCR Buffer 2.5 μL；10 mmol/L dNTPs 2.0 μL；10 μnol/L耐藥基因上下游引物各1.2 μL；Taq酶(5 u/μL)0.2 μL；50 ng DNA模板5 μL，總體積25 μL。擴(kuò)增條件：預(yù)變性93 ℃ 2 min；變性93 ℃ 1 min，退火55 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；最后延伸為72 ℃ 5 min[5]。

1.2.4.2 MLST分型擴(kuò)增體系 10×PCR Buffer 5.0 μL；10 mmol/L dNTPs 4.0 μL；10 μmol/L耐藥基因上下游引物各2.0 μL；Taq酶(5 u/μL)0.25 μL；50 ng DNA模板3.0 μL，總體積50 μL。擴(kuò)增條件：預(yù)變性96 ℃ 1 min；變性96 ℃ 1 min，退火55 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；最后延伸為72 ℃ 10 min[7]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上樣于1.2%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照。

1.2.5 MLST擴(kuò)增產(chǎn)物測序 測序結(jié)果提交至MLST數(shù)據(jù)庫分析網(wǎng)站(www.mlst.net)分析，確定序列型(sequence type，ST)。

1.2.6 聚類以及克隆群分析 運(yùn)用Bionumerics軟件，采用Categorical方法計算不同ST型7個位點的差異，用非加權(quán)配對算術(shù)平均法(Unweighted Pair Group with Arithmetic Averages，UPGMA)進(jìn)行聚類，構(gòu)建聚類樹。運(yùn)用Bionumerics軟件確定不同的克隆群(clonal complexes ，CCs)，7個位點中有5個相同的，認(rèn)為是同一克隆群[8]。

2 結(jié) 果

2.1 MLST分型 7個管家基因PCR產(chǎn)物擴(kuò)增圖譜，條帶清晰，條帶大小acsA(842 bp)、aroE(825 bp)、guaA(940 bp)、mutL(940 bp)、nuoD(1 042 bp)、ppsA(989 bp)、trpE(811 bp)。

M:DNA marker 2000, 2:Positive fragment ofacsAgene, 3:Positive fragment ofaroEgene, 4:Positive fragment ofguaAgene, 5:Positive fragment ofmutLgene, 6:Positive fragment ofnuoDgene, 7:Positive fragment ofppsAgene, 8:Positive fragment oftrpEgene.

圖1 7個管家基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜

Fig.1 Amplification products electrophoretogram of seven housekeeping genes

2.2 62株P(guān)A菌聚類分析圖 不同菌株的科室來源、標(biāo)本種類、ST型及7個管家基因號等詳細(xì)信息見圖2。New1-new13為新發(fā)現(xiàn)ST型別。聚類結(jié)果得到39種不同的ST型。有12種ST型別存在2株以上PA菌，分別為：ST856(7株)，ST381(3株)，ST274(2株)，ST699(2株)，ST260(3株)，ST155(2株)，ST645(2株)，ST244(4株)，new12(2株)，ST357(4株)，ST1752(2株)，ST507(2株)。其余MLST型別較為分散。

圖2 MLST分型64株P(guān)A菌的聚類結(jié)果

2.3 克隆復(fù)合體分析 采用Bionumerics軟件分析得到5個不同的CCs：CC155(包括ST155、ST645)、CC244(包括ST244、ST1929、STnew3、STnew10、ST1623、ST408、ST699、ST1930、ST836)、CC274(包括ST274、STnew7)、CC357(包括ST357、ST1752)、CC1521(包括ST1521、STnew2)。ST155、ST244、ST274、ST357、ST1521分別為5個復(fù)合體的原始ST型。見圖3。不能形成CCs的STs稱為獨特型。

2.4 耐藥基因檢出情況 本研究對62株P(guān)A菌進(jìn)行20種耐藥基因檢測，檢出11種耐藥基因，分別為β-內(nèi)酰胺類耐藥基因：5株菌攜帶TEM基因(8.1%，5/62)，4株菌攜帶SHV基因(6.5%，4/62)；β-內(nèi)酰胺酶類耐藥基因：3株菌攜帶IMP基因(4.8%，3/62)；Ampc酶類耐藥基因：6株菌攜帶DHA基因(9.7%，6/62)；外膜通道蛋白耐藥基因：24株菌攜帶oprD基因(38.7%，24/62)；氨基糖苷類耐藥基因：3株菌攜帶Aac(6′)-Ⅰ基因(4.8%，3/62)，9株菌攜帶Aac(6′)-Ⅱ基因(14.5%，9/62)，3株菌攜帶Aac(3′)-Ⅰ基因(4.8%，3/62)，35株菌攜帶Aac(2″)-Ⅰ基因(56.5%，35/62)；5株菌攜帶qacE1-sull與Ⅰ類整合子基因(8.1%，5/62)。

圖3 62株P(guān)A菌最小生成樹進(jìn)化溯源圖

Fig.3 Distribution of the STs and CCs of the 62 isolates of PA on a dendrogram built

2.5 檢出較少耐藥基因的菌株，見表1。共有10株P(guān)A菌未檢出耐藥基因，病人與環(huán)境各分離5株。病人分離株，僅有2株檢出oprD基因，其余35株菌均存在oprD基因缺失。20株菌僅檢出Aac(2″)-Ⅰ基因。

2.6 檢出2種以上耐藥基因的克隆群及ST型別 見表2。共有13種耐藥基因譜，5株均為oprD+Aac(2″)-Ⅰ耐藥基因譜，其余耐藥基因譜分散。7株攜帶2種耐藥基因，5株攜帶3種耐藥基因，6株攜帶4種以上耐藥基因。

3 討 論

本研究中，5株攜帶Ⅰ類整合子與qacE1-sull基因，其中4株存在oprD基因缺失，5株菌均攜帶4種以上耐藥基因包括β-內(nèi)酰胺、β-內(nèi)酰胺酶以及氨基糖苷類修飾酶基因，與相關(guān)報道相符[9]，證明了在整合子介導(dǎo)的耐藥機(jī)制中，Ⅰ類整合子起著非常重要的作用[10]。整合子具有捕獲、切除、重排耐藥基因的能力，目前已有超過130多種耐藥基因盒可以整合在整合子上，可以編碼臨床上幾乎所有抗生素的抗性基因[11]。Ⅰ類整合子，5′保守區(qū)含有表達(dá)被整合基因盒的增強(qiáng)子區(qū)域，3′保守區(qū)含有編碼耐藥消毒劑qacE1-sull基因[12]。qacE1基因表達(dá)產(chǎn)物可使多種化合物排出胞外，賦予細(xì)菌對季胺類、雙胍類消毒劑耐藥，在醫(yī)院PA菌監(jiān)測中，需加強(qiáng)對攜帶Ⅰ類整合子菌株的監(jiān)測。

表1 未檢出及檢出1種耐藥基因的ST型

表2 檢出2種以上耐藥基因PA菌的CCs與ST型別分布情況

注：⑴-TEM、⑵-SHV、⑶-IMP、⑷-DHA、⑸-oprD、⑹-Aac(6′)-Ⅰ、⑺-Aac(6′)-Ⅱ、⑻-Aac(3′)-Ⅰ、⑼-Aac(2″)-Ⅰ、⑽-qacE1-sull、⑾-int-Ⅰ

40株P(guān)A攜帶氨基糖苷類修飾酶基因，陽性率為64.5%(40/62)，有20株菌僅攜帶Aac(2″)-Ⅰ基因。是本研究中，檢出率最高的耐藥基因，雖與之前研究表型耐藥對氨基糖苷類藥物100%耐藥存在差異，亦表明產(chǎn)氨基糖苷類修飾酶是細(xì)菌對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥的主要原因[13]。

本研究應(yīng)用MLST分型方法結(jié)合Bionumerics軟件進(jìn)行聚類和克隆溯源分析。聚類結(jié)果將62株P(guān)A分為39種MLST型，型別較為分散，與文獻(xiàn)報道一致，可能與PA的基因變異性較高有關(guān)，這種高變異性易導(dǎo)致PA適應(yīng)性強(qiáng)和致病性，容易產(chǎn)生耐藥[14]。最小生成樹結(jié)果，主要有5個克隆群。存在多重耐藥的型別(見表2)，8種ST型檢出2種耐藥基因，5種ST型檢出3種耐藥基因，6種ST型檢出4種以上耐藥基因。

有研究表明CC235、CC111、CC175屬于高風(fēng)險克隆群，易攜帶β-內(nèi)酰胺酶基因(VIM、IMP與SPM)，全世界分布廣泛，呈多重耐藥，在很多國家為引起院內(nèi)感染的優(yōu)勢型別[15-19]，但在本研究中以及國內(nèi)的報道中未分離到ST235、ST175型別[14,20]，可能與地域差異以及標(biāo)本來源的局限性有關(guān)。CC111為獨特型，沒有形成克隆群。本研究中62株P(guān)A形成5個克隆群CC244為較大的克隆群，包括9種ST型別。CC244克隆群中，分離自環(huán)境的菌株不攜帶或者攜帶較少的耐藥基因，耐藥基因譜以氨基糖苷類為主。分離自病人菌株，耐藥基因譜較為復(fù)雜，為多重耐藥，是南山區(qū)主要克隆群。本研究中ST244型攜帶IMP基因，與有關(guān)文獻(xiàn)在中國的多個城市發(fā)現(xiàn)攜帶IMP耐藥基因的ST244型的報道一致[18]。CC155、CC274與CC357克隆群國際上均有報道[15-16]，CC155克隆群包括ST155與ST645，3株分離自環(huán)境，1株分離自病人，僅1株分離自環(huán)境的PA攜帶Aac(2″)-Ⅰ基因，其余3株耐藥基因未檢出。CC274克隆群包括ST274與STnew7，來自不同科室的不同樣本，耐藥譜較為單一，均僅攜帶1種耐藥基因。CC1521包括ST1521與STnew2，此克隆群耐藥譜復(fù)雜是本研究中攜帶耐藥基因最多的克隆群，此克隆群需引起高度重視，避免發(fā)生院內(nèi)感染。

通過聚類發(fā)現(xiàn)，ST856、ST381、ST260雖屬于獨特型，但每種型別都包括3株以上的PA菌，ST856包括7株P(guān)A攜帶耐藥基因較少。環(huán)境與病人中均存在ST381與ST260型。

New1-new13為本研究新發(fā)現(xiàn)的ST型別，new1-new10分離自不同科室病人的不同標(biāo)本，new11-new13分離自環(huán)境樣。New3、new10屬于CC244克隆群，new7屬于CC274克隆群，new2屬于CC1521克隆群，其余屬于獨特型。不同診所出現(xiàn)了相同的ST型別(ST155、ST175、ST507)，僅攜帶oprD基因，為何不同環(huán)境分離PA會出現(xiàn)相同型別，但型別較為分散，無集中優(yōu)勢，菌株之間是否有關(guān)聯(lián)，有待進(jìn)一步研究。

本研究中，院內(nèi)病人分離株與環(huán)境分離株之間有同源關(guān)系的有4個型別：ST381、ST260、ST645、ST244，4個型別分離菌株攜帶耐藥基因較少。醫(yī)院的病人分離株與來自不同醫(yī)院、診所環(huán)境涂抹樣的PA具有同源性，但無優(yōu)勢菌株，亦說明PA作為條件致病菌廣泛存在于環(huán)境中。

(感謝中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所呼吸道傳染病實驗室熱心提供技術(shù)指導(dǎo)。)

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Antibiotic-resistant genes and multilocus sequencing typing ofPseudomonasaeruginosa

YUAN Meng,YUAN Yue-ming,CHEN Hong-bin,LUO Jin-yan,YU Mu-hua,DUAN Yong-xiang

(MicrobiologicalLaboratoryDepartment,NanshanDistrictCenterforDiseaseControlandPrevention,Shenzhen518054,China)

We investigated the antibiotic-resistant genes and genetic diversity ofPseudomonasaeruginosafrom patients in hospital, the smear samples from hospital and clinic environment, and from medical staff’ hands respectively in 2011-2012 in Nanshan District of Shenzhen. Polymerase chain reaction were used to detect the 20 kinds of antibiotic-resistant genes (TEM,VEB,CARB,OXA,SHV,PER,GES,GTX,SPM,GIM,IMP,VIM,DHA,oprD,Aac(6′)-Ⅰ,Aac(6′)-Ⅱ,Aac(3′)-Ⅰ,Aac(2″)-Ⅰ,qacE1-sullandint-Ⅰ). Multilocus sequencing typing was used to analyze the clonal complexes. The 11 kinds resistant genesTEM,SHV,IMP,DHA,Aac(6′)-Ⅰ,Aac(6′)-Ⅱ,Aac(3′)-Ⅰ,Aac(2″)-Ⅰ,qacE1-sull,int-ⅠandoprDwere detected, for the positive rates respectively, and which were 8.1%, 6.4%, 4.8%, 9.7%, 4.8%, 14.5%, 9.7%, 56.5%, 8.1%, and 8.1%; the loss rate ofoprDgene was 61.2%. The 19 antibiotic resistance gene profiles existed in 52Pseudomonasaeruginosastrains. Multilocus sequencing typing found 39 sequence types and 5 clonal complexes in 62Pseudomonasaeruginosastrains, CC244 and ST856 were dominant. There were some differences of antibiotic resistance gene profiles between different samples, thePseudomonasaeruginosastrains from patients carried multiple resistant genes. In our research, thePseudomonasaeruginosahad the genetic diversity and the dominant clonal complexes existed.

Pseudomonasaeruginosa; multi-drug resistance; antibiotic-resistant genes; polymeras chain reaction; multilocus sequencing typing; clonal complexes

深圳市南山區(qū)疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗科，廣東 518054;Email：yuanmeng726@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.10.013

R378.99

A

1002-2694(2015)10-0957-06

2014-12-02；

2015-06-20

深圳市科技計劃項目(201103296)