一種檢測膽螺桿菌套式PCR方法的建立

秦和平,孫 勇,葉安麗,潘信義

一種檢測膽螺桿菌套式PCR方法的建立

秦和平1,孫 勇2,葉安麗1,潘信義1

目的 建立一種敏感性高、特異性強的檢測膽螺桿菌的套式PCR方法。方法 基于17種膽螺桿菌亞種的16S rRNA 基因設計篩選出1套套式引物(2條內引物、2條外引物)，優化反應條件后，通過模擬糞便標本、動物模型標本和臨床標本的檢測對方法的敏感性和特異性進行評估。結果 模擬糞便標本中，該方法檢測膽螺桿菌的敏感性達到10 CFU/100 μL。3例感染膽螺桿菌的SPF級BALB/c小鼠模型中，3例小鼠糞便和盲腸中均可檢測到膽螺桿菌，1例肝臟標本中檢測到了膽螺桿菌。10例膽石病患者中，有2例患者的膽汁、膽囊粘膜和糞便標本中檢測到了膽螺桿菌。結論 本研究建立的套式PCR方法，敏感性高、特異性強，可用于檢測膽螺桿菌的感染。

膽螺桿菌； 套式PCR； 16S rRNA

1995年Fox等從自交系小鼠的膽汁、肝臟及腸道中分離出一種新的腸肝螺桿菌-膽螺桿菌(helicobacterbilis，H.bilis)[1]。它的感染會影響動物實驗的結果。1998年，Fox等在智利的研究發現，慢性膽囊炎患者的膽汁及膽囊粘膜中有H.bilis的DNA存在[2]。另外，一些研究則報道H.bilis的感染可能引起人腸炎[3-4]。因此，檢測H.bilis對動物實驗的質量控制和人類消化系統疾病的研究意義重大。另外，隨著H.bilis亞種的不斷增多，有必要根據更新的數據庫重新設計引物。目前，核糖體數據庫RDP(http://rdp.cme.msu.edu/)提供了17種H.bilis亞種的16S rRNA。本研究基于此建立一種檢測H.bilis高敏感性和特異性的套式PCR方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1H.bilis(ATCC43879)來自南方醫院消化科。

1.1.2 選取3只SPF級的BLAB/c 小鼠經胃灌入200 μL含有H.bilis的PBS液 (107-9CFU/只)，建立感染H.bilis的動物模型后處死(1～6 周)，取其肝臟、盲腸及糞便標本。造模前，我們提前收集BLAB/c小鼠糞便標本,用我們的檢測方法和文獻中的檢測方法(C97-C05、C97-C98)明確沒有H.bilis的感染[2,5]。整個過程經過了南方醫科大學動物管理及使用委員會的同意。

1.1.3 -80 ℃保存1位健康人糞便標本用于模擬糞便標本。健康人指無膽石病、膽囊炎、膽囊癌、肝炎及肝癌，用我們的方法和文獻中的方法(C97-C05、C97-C98)檢測糞便標本H.bilis陰性。

1.1.4 本研究納入10位因膽石癥擬行膽囊切除術的患者，患者近4周未服用以下藥物：H2組胺受體阻斷劑、抗生素、質子泵抑制劑、鉍劑。術前留取糞便標本，術后留取膽汁、膽囊粘膜標本，均保存于-80 ℃冰箱內。

1.2 方法 用DNAMAN8.0(序列分析比對軟件包)分析比對17種H.bilis亞種的16S rRNA，確定保守區和可變區。Primer Primier6.0(引物設計軟件)設計引物，OLIGOU7.0(引物設計評估軟件)分析、評估，選取最優引物。

表1 17種膽型螺旋桿菌亞種的16S rRNA

表2 本研究設計的套式引物序列及反應條件

1.2.2H.bilis菌株密集劃線接種在空腸彎曲菌選擇性瓊脂培養基，添加5%～10%凍融脫纖維羊血，微需氧條件下(5% O2，85% N2和10% CO2) 37 ℃培養3～7 d。

1.2.3 細菌基因組DNA的提取使用Qiagen RNA/DNA Mini Kit (Qiagen Inc.德國)，糞便、膽汁及組織DNA的提取使用QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen Inc.德國)。

1.2.4 PCR擴增體引物(如表2 所示)由華大基因公司合成。兩輪反應的預變性條件均為94 ℃ 3 min，終止反應條件均為72 ℃7 min。第一輪反應：PCR 反應體系為50 μL，2×Premix Taq 25 μL，上、下游引物各1 μL (0.2 mmol/L)，模板5 μL，無菌去離子水補足至50 μL，30個循環；第二輪反應：PCR 反應體系為50 μL，2×Premix Taq 25 μL，上、下游引物各1 μL (0.2 mmol/L)，第一步PCR產物稀釋100倍后取1 μL作為模板，無菌去離子水補足至50 μL，30個循環，最后PCR產物瓊脂糖凝膠電泳。PCR產物測序由華大基因公司負責(美國ABI公司的3730XL測序分析儀，Bigdye V3.1 Mix kit， POP7測序膠，PCR產物原液經柱純化后單向測序)。為避免假陽性和假陰性條帶，我們從提取DNA到PCR擴增設置陽性對照(H.bilis)和陰性對照(雙蒸水)。

1.2.5 模擬糞便標本的敏感性檢測使用比濁儀調整菌液至0.5麥氏單位， 約相當于1.5×107CFU/100 μL，用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)進行稀釋，稱取健康人糞便0.2 g/管，加入0.7 mL PBS，加入各稀釋度的菌液0.1 mL混勻，制備成一定的菌懸液模擬標本，最終菌液濃度分別為106、105、104、103、102、10、1 CFU/100 μL， 陰性對照加入0.8 mL 的PBS，上述的各稀釋度與糞便標本混勻，1 000 r/min 離心10 min，把上清轉入另一個離心管中，12 000 r/min離心10 min，離心后棄上清，用試劑盒提取DNA，用建立好的PCR方法檢測各稀釋度的標本。

2 結 果

我們設計的套式PCR法檢測模擬糞便標本的最低濃度達到了10 CFU/100μL。它不僅能檢測出小鼠糞便標本、肝臟和盲腸標本的H.bilis,而且在2例膽石病患者的膽囊膽汁、膽囊粘膜及糞便標本中也檢測出了H.bilis。這種對H.bilis特異的套式PCR法于動物實驗的質量控制和人感染H.bilis的研究意義重大。

2.1 模擬糞便標本的敏感性檢測 以10倍梯度稀釋制備的糞便模擬標本，提取DNA后進行PCR擴增, 可以檢測的最低菌液濃度為10CFU/100 μL(圖1)。

2.2 3只SPF級BALB/c小鼠造模前后糞便標本的檢測。造模后3例糞便標本中檢測到了334 bp的特異條帶，測序后比對為H.bilis的16S rDNA部分片段(圖2)。

2.3 3只SPF級BALB/c小鼠造模后，1例肝臟標本和3例盲腸標本均檢測到了334 bp的特異條帶，測序后比對為H.bilis的16S rDNA部分片段(圖3)。

2.4 10例膽石病患者中，2例患者的膽汁(圖4-A)、膽囊粘膜(圖4-B)及糞便(圖4-C)標本中均檢測到了334 bp的特異條帶，測序后比對為H.bilis的16S rDNA部分片段。

Tenfold dilutions of pure bacterial culture were spiked into healthy human stool, and nested PCR was performed by using the extracted DNA from contaminate stool.

M:markers (Omega Marker DL-2000); PC:positive control; NC:negative control; 1:106CFU/100 μL; Lane 2:105CFU/100 μL; 3:104CFU/100 μL; 4:103CFU/100 μL; 5:102CFU/100 μL; 6:10CFU/100 μL; 7:1 CFU/100 μL.

圖1 基于H.bilis16s rDNA的特異性套式PCR法敏感性檢測

Fig.1 Sensitivity of detection ofH.bilis-specific 16s rDNA gene by the nested PCR

M:markers (Omega Marker DL-2000); PC:positive control; NC:negative control; 1 to 3:mice uninfected withH.bilis; 4 to 6:mice infected withH.bilis.

圖2 套式PCR法檢測造模前后小鼠的糞便標本

Fig.2 Nested PCR amplification of DNA extracted from feces samples from uninfected control and infected mice

3 討 論

H.bilis是一種重要的腸肝螺桿菌，小鼠是其自然宿主。它主要定植于小鼠的肝膽系統，也可下行至小鼠的結腸，可導致小鼠慢性肝炎、膽囊炎及慢性腸炎，影響動物實驗的結果[1]。Maurer等的研究發現H.bilis感染與小鼠膽石癥的發生相關[6]，為我們研究人類膽石病提供了一種很好的模型。兩份來自亞洲的研究發現，亞洲人群中膽管癌和膽囊癌的粘膜標本中H.bilis的陽性率非常高[7-8]。Okoli等的研究也提示人類原發性肝癌的發生中H.bilis和HCV病毒有協同作用[9]。因此，研究H.bilis的意義重大。

M:markers (Omega Marker DL-2000); PC:positive control; NC:negative control; 1 to 3:liver samples; 4 to 6:ceacum samples.

M:markers (Omega Marker DL-2000); PC:positive control; NC:negative control; 1 to 10:ten patients with cholelithiasis.

Fig.4 Nested PCR amplification of DNA extracted from biles (A), cholecyst mucous membranes (B) and feces (C) samples from patients with cholelithiasis

但H.bilis是苛養菌，培養條件和設備要求高，培養法敏感性差。血清學檢查要在培養法基礎上取得抗原，而且多是基于多克隆抗體，假陽性率高。因此，PCR及測序是檢測H.bilis的金標準[1]。16S rDNA 因其序列高度保守，長度適宜，被大多數研究人員作為首選靶序列。但臨床標本PCR檢測的敏感性和特異性受到體內細菌的和人體組織DNA的影響，容易出現錯配，常出現假陰性的結果[10]。套式PCR有內外兩對引物，通過2輪特異性擴增，可以很大程度上減少錯配的出現，提高檢測H.bilis的敏感性和特異性。

本研究根據最新的RDP數據庫，設計并建立了一種套式PCR方法。模擬糞便標本的環境富含腸道細菌和少量人體的DNA。這種環境下，該檢測方法的敏感性可達到10 CFU/100 μL。感染H.bilis的3只BALB/c小鼠模型中，雖然只有1例小鼠肝臟標本中檢測到了H.bilis，但3例小鼠的盲腸及糞便標本中都檢測到了H.bilis，原因可能是H.bilis逆行感染肝膽需要的時間更長。另外，我們還用這種方法檢測了10例膽石病患者的膽汁、膽囊粘膜及糞便標標本。術前提前凍存的糞便標本有2例檢測到了H.bilis；術后也是這2例患者的膽汁和膽囊粘膜標本中檢測到H.bilis。綜上所述，該方法檢測H.bilis敏感性高，特異性強，對動物實驗的質量控制和研究H.bilis感染對人疾病的影響意義重大。

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Development of a nested PCR assay for detection ofHelicobacterbilis

QIN He-ping1,SUN Yong2,YE An-li1,PAN Xin-yi1

(1.LiuzhouPeople’sHospital,Liuzhou545006,China;2.NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

In this study, the objective is to establish a nested-PCR assay for the detection ofH.biliswith high sensitivity and specificity. The nested primers were designed based on sequences of 16S rRNA gene of seventeen subtypes ofH.bilis. After optimizing reaction condition, the sensitivity and specificity of the assay were examined via the detection of feces simulated samples, mice infection model samples and clinic patients’ samples. The detection sensitivity ofH.bilisstrain for feces simulated samples was 10 CFU/100 μL.H.biliswas successfully detected in the liver, caecum and feces of experimentally infected mice. Moreover,H.biliswas successfully detected in the bile, cholecyst mucous membrane and feces samples from two of ten patients with cholelithiasis. Due to the PCR assay’s high sensitivity and specificity, the method may be used to detect the infection ofH.bilis.

H.bilis; nested PCR assay; 16S rRNA

Pan Xin-yi, Email:panxinyilz@126.com

廣西省衛生廳基金項目(No.Z2013651)；柳州市人民醫院“碩博醫學基礎研究啟動基金”項目(No.lryjj201408)

潘信義，Email：panxinyilz@126.com

1.柳州市人民醫院醫療保健部一病區，柳州 545006； 2.南方醫院消化內科，廣州 510515

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.10.010

R378.99

A

1002-2694(2015)10-0943-04

2015-01-30；

2015-07-31

Funded by the Health Department Fund Project of Guangxi Province (No. Z2013651) and the Foundation Medicine Research Fund for Graduate in Liuzhou People’s Hosptial (No. lryjj201408)