氣單胞屬菌糞便分離株分子鑒定與耐藥元件檢測

翁幸鐾，糜祖煌，周鐵麗

氣單胞屬菌糞便分離株分子鑒定與耐藥元件檢測

翁幸鐾1，2，糜祖煌3，周鐵麗1

目的 調查一組14株氣單胞屬菌的菌種分子鑒定情況，以及β-內酰胺酶類、氨基糖苷類耐藥的遺傳學背景。方法 14株氣單胞屬菌均分離自2012年1月至12月寧波市第一醫院腸道門診腹瀉患者的糞便標本，再作通用引物16SrDNA測序比對判定菌種，然后用聚合酶鏈反應(PCR)的方法分析23種β-內酰胺酶基因、6種氨基糖苷類修飾酶基因和6種16SrRNA甲基化酶基因以及6種可移動遺傳元件分子標記。結果 本組14株菌經16SrDNA測序比對,10株為嗜水氣單胞菌, 水簇箱氣單胞菌、溫和氣單胞菌、腸棕氣單胞菌、斑點氣單胞菌各1株。14株氣單胞菌共檢出5種β-內酰胺酶基因、4種氨基糖苷類修飾酶基因和3種可移動遺傳元件遺傳標記基因。其中4號株(嗜水氣單胞菌)AQU基因是新的基因亞型，命名為AQU-2, 11號株(水簇箱氣單胞菌)AQU基因也是新的基因亞型，命名為AQU-3。結論 氣單胞菌屬的菌種鑒定應該以分子鑒定法為準。本組14株氣單胞屬菌耐藥嚴重，已呈多重耐藥。

氣單胞屬菌；分子鑒定；耐藥基因；基因亞型；可移動遺傳元件

氣單胞屬菌(Aeromonas)為革蘭氏陰性短桿菌，屬內已被命名的菌種已超過20種。氣單胞屬菌為條件致病菌，是典型的人—獸—魚共患病原菌。氣單胞屬菌可致宿主腸道疾病和腸外疾病。最近，我們從人糞便中分離到一組經儀器鑒定為氣單胞屬菌,為了確認菌種進一步作了16SrDNA測序比對(即菌種分子鑒定)。并進行了23種β-內酰胺酶基因、6種氨基糖苷類修飾酶基因和6種16SrRNA甲基化酶基因以及6種可移動遺傳元件分子標記檢測,現報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 14株菌均為分離自寧波市第一醫院腸道門診腹瀉患者的糞便標本,經法國bioMerieux公司Vitek 2-Compact全自動微生物鑒定儀及配套革蘭陰性菌鑒定卡進行菌株鑒定為氣單胞屬菌。

1.2 細菌分子鑒定 14株菌均作通用引物16SrDNA測序,測得序列上網比對(www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide)判定菌種。16SrDNA擴增與測序引物序列為:P1:5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′; P2:5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT -3′[1]。16SrDNA PCR試劑盒和陽性對照DNA由無錫市克隆遺傳技術研究所提供。

1.3 藥敏試驗 采用法國生物梅里埃公司VITEK 2-Compact全自動微生物鑒定儀及配套革蘭陰性菌藥敏卡進行藥物敏感性檢測。再根據2014年美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)的標準進行抗菌藥物敏感性判斷。

1.4 細菌基因檢測模板處理 挑取單個菌落，置入0.5 mL的eppendorf離心管(管內預置濃度為200 μg/L的蛋白酶K溶液400 μL),加蓋后放置56 ℃水浴2 h,然后放置95 ℃水浴10 min。基因檢測模板即完成,模板液放置-20 ℃冰箱保存備用。

1.5 基因檢測 23種β-內酰胺酶基因(包括A類、C類、D類β-內酰胺酶基因, B類β-內酰胺酶基因因本組菌株無碳青霉烯類藥物耐藥株故未作檢測)、6種氨基糖苷類修飾酶基因和6種16SrRNA甲基化酶基因以及6種可移動遺傳元件分子標記檢測均為PCR法。PCR靶基因引物識別序列和目的產物長度見表1。各種靶基因PCR擴增體系均為:每反應體系P1引物1 μL(1.0 μmol/L)、P2引物1 μL(1.0 μmol/L),dNTPs 2 μL(2 mmol/L), 10倍緩沖液2 μL(KCl 10 mmol/L,(NH4)2SO48 mmol/L，MgCl22 mmol/L，Tris-HCl(pH9.0)10 mmol/L，NP400.5%，BSA 0.02%(wt/vol))，Taq DNA pol 1U(不計體積),超純水9 μL, 模板液5 μL,總反應體積20 μL。PCR擴增產物>500 bp熱循環參數均為：93 ℃預變性2 min，然后93 ℃60 s→55 ℃60 s→72 ℃60 s，循環35周期，最后一個72 ℃延長至5 min,其余均為：93 ℃預變性2 min，然后93 ℃30 s→55 ℃30 s→72 ℃ 60 s，循環35周期，最后一個72 ℃延長至5 min。產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，出現與陽性對照分子相當的目的條帶為陽性。基因檢測試劑盒和陽性對照DNA由無錫市克隆遺傳技術研究所提供(PCR引物序列由無錫市克隆遺傳技術研究所糜祖煌根據2013年2月1日之前已在www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide登錄的各種序列的保守區域完成設計,并獲授權使用)。

表1 靶基因引物識別序列和目的產物長度

表1(續表1)

表1(續表2)

1.6 陽性基因測序 PCR陽性產物為PCR直接全自動熒光法測序,委托上海博尚生物技術有限公司完成(測序在美國ABI公司3730型毛細管全自動測序儀上進行)。

1.7 測得序列比對 讀序工具軟件為Chromas,測序結果用Chromas直接作BLAST Search比對, 或拼接成全長序列后作BLASTn比對。

2 結 果

2.1 菌株分子鑒定結果 本組14株菌經16SrDNA測序上網比對,10株為嗜水氣單胞菌(A.hydrophila),另外水簇箱氣單胞菌(A.aquariorum)、溫和氣單胞菌(A.sobria)、腸棕氣單胞菌(A.enteropelogenes)、斑點氣單胞菌(A.punctata)各1株。14株氣單胞屬菌進一步作藥敏檢測和耐藥檢測。

2.2 藥敏試驗結果 14株氣單胞屬菌對抗菌藥物的藥敏試驗結果見表2。

2.3 耐藥元件檢測結果 14株氣單胞屬菌耐藥元件檢測結果與部分β-內酰胺類、氨基糖苷類藥物藥敏結果見表3,表4為14株氣單胞屬菌耐藥元件檢測結果，共檢出5種β-內酰胺酶基因、4種氨基糖苷類修飾酶基因和3種可移動遺傳元件遺傳標記基因。其中4號株(嗜水氣單胞菌)AQU基因測得1 143 bp與美國GenBank已登錄的AQU序列不同,被命名為AQU-2正在登錄美國GenBank,其中11號株(水簇箱氣單胞菌)AQU基因測得1149 bp亦與美國GenBank已登錄的AQU序列不同,被命名為AQU-3正在登錄美國GenBank。2號株(嗜水氣單胞菌)、3號株(嗜水氣單胞菌)、5號株(嗜水氣單胞菌)的aac(6’)-Ⅰb-cr序列亦正登錄美國GenBank。

3 討 論

在水產養殖領域,國內魚、蟹、鱉疾病與氣單胞菌感染的關系研究頗多。

在臨床醫學領域，國內主要為氣單胞菌感染導致腹瀉的個案報道。進入本世紀后有幾起氣單胞菌感染導致群體性腹瀉的報道[2-3]，和氣單胞菌致急性白血病患者皮膚軟組織感染[4]和肝硬化患者敗血癥的個案報道[5]。除此之外，國外還報道了氣單胞菌導致的多種腸外感染，如傷口感染、尿路感染、肝膽道感染,軟組織感染、腦膜炎[6]，免疫缺陷兒童可引起更嚴重的溶血性尿毒綜合征(HUS)、壞死性筋膜炎[7]。

但氣單胞菌屬的菌種鑒定，常規的生化鑒定法準確率不高，應該以分子鑒定法為準。本文儀器判讀為氣單胞菌的14株菌,經16SrDNA測序比對,10株為嗜水氣單胞菌, 另外水簇箱氣單胞菌、溫和氣單胞菌、腸棕氣單胞菌、斑點氣單胞菌各1株。

表2 14株氣單胞屬菌對抗菌藥物的藥敏試驗結果(%)

表3 14株氣單胞菌屬耐藥元件檢測結果與部分β-內酰胺類、氨基糖苷類藥物藥敏結果

注：本組1-10號菌為A.hy：嗜水氣單胞菌，11號菌為A.aq：水簇箱氣單胞菌、12號菌為A.so：溫和氣單胞菌、13號菌為A.en：腸棕氣單胞菌、14號菌為A.pu：斑點氣單胞菌。因9、10、13、14號菌未檢出上述陽性基因，故未列出。未檢出陽性基因的項目亦未列出。

Cefatriaxone：頭孢曲松、Gentamycin：慶大霉素、Amikacin：阿米卡星、R：耐藥、S：敏感。

Note:The items of negative genes are not listed.

表4 14株氣單胞屬菌耐藥元件檢測結果匯總

Note:The items of negative genes are not listed.

國外的相關研究也證實了這點。Aravena-Román M等對104株生化鑒定為嗜水氣單胞菌，用分子鑒定法(rpoD+gyrB)再次鑒定，發現符合率只有33.6%(35/104)，其它分別為氣單胞菌屬其它菌種[8]。Figueras MJ等對150株生化鑒定為氣單胞菌屬細菌，用16S rDNA-RFLP法重新鑒定，138株(92%)證實為氣單胞菌屬各個種，仍有24株(17.5%)還是無法鑒定，繼續用rpoD+gyrB法鑒定到種[9]。Martínez-Murcia AJ等從水體和進口觀賞魚皮膚分離到48株氣單胞菌屬細菌，用常規生化法無法鑒定到種，他們聯用gyrB+rpoD法、16S rRNA法、DNA-DNA雜交法、MALDI-TOF MS法、RAPD基因分型法來鑒定菌種[10]。

從表2可見，本組14株氣單胞屬菌耐藥嚴重，已呈多重耐藥。氣單胞屬菌特有的AQU基因是染色體介導的C類β-內酰胺酶編碼基因(AmpC酶編碼基因)，最近由臺灣研究人員在達卡氣單胞菌(Aeromonasdhakensis)、嗜水氣單胞菌、水簇箱氣單胞菌中檢測到，可介導頭孢噻肟耐藥[11]。本組4號株(嗜水氣單胞菌)檢出了AQU-2，11號株(水簇箱氣單胞菌)檢出了AQU-3。另一種氣單胞屬菌特有的CepS/CepH基因在本組菌中未檢出。國內在臨床醫學領域尚無對分離株進行分子鑒定對菌株“驗明正身”,然后進行23種β-內酰胺酶基因、6種氨基糖苷類修飾酶基因和6種16SrRNA甲基化酶基因以及6種可移動遺傳元件分子標記檢測的報道。

如表3所示，檢出β-內酰胺酶基因的菌株對β-內酰胺類抗生素表現為不同程度的耐藥；5號、10號、13號這3株菌，未檢出β-內酰胺酶基因，因此對β-內酰胺類敏感。但6號、9號、14號這3株β-內酰胺酶基因陰性的菌株，對β-內酰胺類耐藥，推測可能存在新的β-內酰胺酶基因。氨基糖苷類的基因型和表型對應較好。

氣單胞菌屬細菌也攜帶了大量的毒力因子，包括溶血素、細胞興奮素、細胞毒性腸毒素、蛋白酶、脂酶、殺白細胞素、內毒素、粘附素和S層[12]。這些毒力因子和致病力的相關性值得我們做進一步深入研究。

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Molecular identification and resistant derterminants ofAeromonassp. isolated from stool of human

WENG Xing-bei1,2,MI Zu-huang3,ZHOU Tie-li1

(1.WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China;2.MedicalLaboratoryDepartment,NingboFirstHospital,Ningbo315010,China;3.WuxiCloneGen-TechInstitute,Wuxi214026,China)

We investigated molecular identification of a group of 14 strains ofAeromonassp., and genetic background of resistance to beta-lactams, aminoglycosides. From January to December 2012, 14 strains ofAeromonassp. were collected from stool from diarrheal patients in enteric clinics in Ningbo First Hospital in Zhejiang Province, China. Then, molecular identification by 16SrDNA, 23 kinds of beta-lactamase genes, 6 kinds of aminoglycoside modifying enzyme genes, 6 kinds of 16srRNA methylase genes, and 6 kinds of mobile genetic elements were analyzed by PCR. In addition, genotyping and sample cluster analysis were performed. Results showed that 10 strains ofA.hydrophila, 1 strain ofA.aquariorum,A.sobria,A.enteropelogenes,A.punctatawere confirmed by 16SrDNA sequencing and arithmetic. Five kinds of beta-lactamase genes, 4 kinds of aminoglycoside modifying enzyme genes, and 3 kinds of mobile genetic elements were positive.BlaAQU of strain No.4(AQU-2) and strain No.11(AQU-3) were new subtypes. It’s suggested that identification ofAeromonassp. should be performed by molecular identification method. This group of 14 strains ofAeromonassp. conferred multidrug resistance.

Aeromonas; molecular identification; resistant determinant; subtype; mobile genetic element

Zhou Tie-li, Email:wyztli@163.com

周鐵麗，Email：wyztli@163.com

1.溫州醫科大學，溫州 325035； 2.寧波市第一醫院檢驗科，寧波 315010； 3.無錫市克隆遺傳技術研究所，無錫 214026

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.10.008

R378.2

A

1002-2694(2015)10-0931-07

2015-01-21；

2015-08-11

浙江省中醫藥基金(2011ZB126),寧波市自然科學基金(2012A610186)

Supported by the Traditional Chinese Medicine Foundation of Zhejiang Province (No. 2011ZB126), the Ningbo Natural Science Foundation (No. 2012A610186)