中國西部人群PARP－1基因SNP位點多態性與胰腺癌易感性的關系＊

李汛 張奇煜 嚴俊 何雯婷 周文策 張磊 孟文勃 白仲添 朱克祥 朱曉亮

（蘭州大學第一醫院普外二科·甘肅省肝膽胰外科研究所，甘肅蘭州730000）

胰腺癌（Pancreatic cancer，PC）是一種高度惡性腫瘤，5年生存率不足5%［1］，是目前預后最差的腫瘤。胰腺癌的病因尚未完全明了，大量證據表明遺傳因素和環境因素的協同作用是胰腺癌發生的主要原因［2］。資料表明，某些腫瘤相關基因的多態性與胰腺癌的發病風險相關，有助于早期發現胰腺癌［3］。聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶－1（polymerase－1，PARP－1）具有保持染色體結構的完整、參與DNA復制和轉錄的功能，在維持基因組穩定和細胞死亡過程中發揮作用。PARP－1存在多個多態性位點，目前對于PARP－1的SNPs與腫瘤的易感性的研究，主要集中生殖系腫瘤、肺癌和胃癌方面，但有關PARP－1的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）與胰腺癌易感性的關系文獻報道較少。本文通過檢測胰腺癌患者PARP－1基因的多態性，并與良性對照組作比較，以探討PARP－1基因SNP多態性與胰腺癌的發病風險關系，尋求胰腺癌早期診斷的分子標記。

1 資料與方法

1.1 研究對象 胰腺癌組選擇2008年1月～2011年3月于蘭州大學第一醫院普外科住院患者，行手術治療并經術后病理證實胰腺癌66例，其中男性44例，女性22例。年齡36～75歲，平均（57.9±11.2）歲；對照組：選擇同期良性胰腺疾病患者85例，男性45例，女性40例，年齡22～85歲，平均年齡（56.3± 13.4）歲。并獲得其同意，調查研究對象的流行病學資料，采集以下信息：①人口學特征，如年齡、性別等。②病史及藥物使用情況。③吸煙史和飲酒史。④癌癥家族史：研究對象至少有一個直系親屬（包括父母、兄弟或姐妹）是癌癥患者，被認為是有家族史。納入和排除標準同前述。患者一般資料，見表1。

表1 兩組患者的一般特征比較［n（×10－2）］Table 1 The general data of the patients

1.2 方法

1.2.1 試劑及標本 血液DNA抽提試劑盒、iPLEX反應試劑、384－well SpectroCHIP生物芯片、HOTSTART taq酶、SAP酶、純化瓊脂等。研究對象抽靜脈血5ml（EDTA抗凝），－70℃保存。提取全血基因組DNA，用于SNP位點檢測。

1.2.2 PARP－1 Val 762Ala（T2444C）多態性基因檢測SNP分型 采用美國Sequenom公司的Mass ARRAYTM Analyzer技術平臺進行SNP檢測：①設計合成引物：通過PCR擴增、PCR引物和單堿基延伸引物均由Assay Designer（Sequenom）軟件包設計。引物合成由深圳華大生物工程技術服務有限公司完成。所有DNA樣本稀釋到5 mg／L后，取1μl，將其與0.95μl水、0.625μl PCR緩沖液（含2 mmol／L MgCl2）、1μl的2.5 mmol／L d NTP、0.4μl的25 mmol／L MgCl2、1μl PCR引物以及0.1μl HotStar Taq酶（Qiagen）混合在一起。PCR反應條件：94℃，15min；94℃，20 s；56℃，30 s；72℃，1 min；共45個循環；最終72℃3 min。②SAP酶處理，降解擴增用的d NTP：PCR擴增后，剩余的d NTP將被去磷酸消化掉，反應體系包括1.53μl水、0.17μl SAP緩沖液、0.3μl堿性磷酸酶，該反應在37℃進行40 min，然后85℃，5 min使酶失活。③延伸引物單堿基延伸反應程序：堿性磷酸酶處理后，針對SNP的單堿基延伸引物在下列反應體系中進行：0.619μl水、0.2μl 10×iPLEX緩沖液、0.2μl終止混合物、0.041μl iPLEX酶，0.94μl的10μmol／L延伸引物.單堿基延伸反應在下列條件下進行：94℃，30 s；94℃，5 s；52℃，5 s；80℃，5 s；5個循環，共40個循環；最后72℃，3 min。④樹脂除鹽純化：在終止反應物中加入6 mg陽離子交換樹脂脫鹽，混合后加入25μl離子水懸浮，離心5min（3000rpm）。⑤質譜檢測：使用Mass ARRAY Nanodispenser將最終的分型產物點樣到一塊384孔的spectroCHIP（Sequenom）上，并用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀進行分析，最終結果由Mass ARRAYRT軟件系統（版本號4.0）實時讀取，并由Mass ARRAY Typer軟件系統（版本號4.0）完成基因分型分析。5%的樣本隨即接受重復檢測，以驗證檢測的重復性及穩定性。

1.3 統計學處理 所用統計學分析軟件為SPSS 13.0，分類變量和基因分型在兩組中的分布差異用χ2檢驗。檢驗水準為5%。以非條件logistic回歸計算比值比（odds ratio，OR）及其95%可信區間（confidence interval，CI）評價各基因型及單體型與胰腺癌發病風險的關系。所有統計檢驗均為雙側檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

實驗檢測的PARP－1 Val762Ala（T2444C）有TT、CT、CC 3種基因型。以野生型TT為對照，TC基因型與胰腺癌發病風險增高相關（OR 2.476，95% CI：1.159～5.292，P＝0.018）；CC基因型與胰腺癌發病風險增高相關（OR 5.778，95%CI：2.278～ 14.657，P＜0.001）；P ARP－1 2444 C等位基因（CT＋CC）個體患胰腺癌的風險是野生型者的3.377倍（OR 3.377，95%CI：1.715～6.646（P＜0.001），見表2。

表2 PARP－1 Val762Ala（T2444C）基因型分布和胰腺癌危險性的關系Table 2 Relation of genotype of PARP－1 Val762Ala（T2444C）and risk of pancreatic cancer

3 討論

目前普遍認為，胰腺癌的發病同多數惡性腫瘤一樣，是遺傳因素和環境因素共同作用的結果，環境致癌物及／其代謝產物攻擊機體細胞引起DNA損傷。當DNA損傷不能及時有效地修復，積累到一定程度導致基因組不穩定性升高，引起細胞增殖和分化失控，導致腫瘤的發生。研究表明DNA修復能力的差異是決定腫瘤易感性的重要因素。DNA修復基因的變異可影響DNA修復能力，從而影響腫瘤在人群中的發病風險［4，5］。

PARP家族共有7個成員，PARP－1是第一個被發現和研究得最清楚的一個成員。在PARP－1的17號外顯子第2444位核苷酸由T至C的轉換導致了第762位的氨基酸由Val突變為Ala。第762位氨基酸位于PARP－1的酶接觸反應區，在多種物種中都是高度保守的。研究表明PAPR－1基因Val762Ala（T2444C）的多態性可增加食管癌、肺癌、胃癌的發病風險［7～9］。Lockett［10］研究顯示Val762Ala的Ala的Ala／Ala基因型能增加前列腺癌的發病風險，降低酶的活性。通過數據分析，本組發現 PARP－1 Val762Ala（T2444C）多態性與胰腺癌的發病風險相關，PARP－1 2444 TC基因型個體患胰腺癌的風險是野生型TT攜帶者的2.476（OR 2.476，95%CI：1.159～5.292，P＝0.018）；CC純合突變型個體患胰腺癌發病風險是野生型TT攜帶者的5.778倍（OR 5.778，95%CI：2.278～14.657，P＜0.001）；PARP－1 2444 C等位基因（CT＋CC）個體患胰腺癌的風險是野生型者的3.337倍（OR 3.337，95%CI：1.715～6.646，P＜0.001）（OR 0.382，95%CI：0.204～0.715，P＝0.002）。研究表明PARP－1Val762Ala的多態性可降低PARP－1活力的40%［11］，導致修復DNA損傷的能力降低，從而可能增加個體對胰腺癌發病的易感性。本研究有待進一步擴大樣本量在不同地域人群中進行深入研究和討論，最終確定PARP－Val762Ala（T2444C）能否作為胰腺癌的一個易感性標志物。

4 結論

本文結果顯示PARP－1 Val762Ala（T2444C）單核苷酸多態性與膽管癌易感性相關，C等位基因型攜帶者患胰腺癌風險較高，PARP－1 Val762Ala（T2444C）單核苷酸多態性可作為預測胰腺癌的生物標志物。

［1］Di Magno EP，Reber HA，Tempero MA，et al.AGA technical review on the epidemiology，diagnosis，and treatment of pancreatic ductal adenocarcinoma［J］.Gastroenterology，1999，17：1464－1484.

［2］Vitone LJ，Greenhalf W，McFaul CD，et al.The inherited genetics of pancreatic cancer and prospects for secondary screening［J］.Best Pract Res Clin Gastroenterol，2006，20：253－283.

［3］ 劉海林，王 磊.胰腺癌早期診斷與治療的研究進展［J］.世界華人消化雜志，2009，17（34）：3475－3479.

［4］Ladeiras－Lopes R，Pereira AK，Nogueira A，et al.Smoking and gastric cancer：systematic review and meta－analysis of cohort studies［J］.Cancer Causes Control，2008，19：689－701.

［5］ 葉慈慈，黃智銘，周春燕，等.APE1 D148E、PARP1 V762A、XRCC1 R399Q的多態性與結直腸癌的易患性［J］.世界華人消化雜志，2010，18（12）：1275－1279.

［6］Duell EJ，Holly EA，Bracci PM，et al.A population－based，case－control study of polymorphisms in carcinogen－metabolizing genes，smoking，and pancreatic adenocarcinoma risk［J］.Natl Cancer Inst，2002，94：297－306.

［7］Matilde Parre?o，Isolda Casanova，María Virtudes Céspedes，et al.Bobel－24 and Derivatives Induce Caspase－Independent Death in Pancreatic Cancer Regardless of Apoptotic Resistance［J］. Cancer Res，2008，68：6313－6323.

［8］Niranjan Awasthi，Amanda Kirane，Margaret A Schwarz，et al. Smac mimetic－derived augmentation of chemotherapeutic response in experimental pancreatic cancer［J］.BMC Cancer，2011，11：15－23.

［9］Quanbao Zhang，Yumin Li，Xun Li，et al.PARP－1 Val762Ala polymorphism，Cag A＋H.pylori infection and risk for gastric cancer in Han Chinese population［J］.Mol Biol Rep，2009，36：1461－146.

［10］Lockett KL，Hall MC，Xu J，et al.The ADPRT V762A genetic variant contributes toprostate cancer susceptibility and defi cient enzyme function［J］.Cancer Res，2004，64：6344－6348.

［11］Xiao－Gan Wang，Zhao－Qi Wang，Wei－Min Tong.PARP1 Val762Ala polymorphism reduces enzymatic activity［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2007，354：122－126.