HBV微環(huán)DNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建及初步藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

饒桂榮，張換敬，黃 彬，陳光明，王洪敏，楊富強(qiáng)

HBV感染慢性化的發(fā)生除HBV本身的生物學(xué)特性外，更重要的是取決于機(jī)體的免疫應(yīng)答狀態(tài)，因此建立一種不僅能預(yù)防HBV感染，更能有效免疫清除肝細(xì)胞內(nèi)病毒的治療性疫苗，是當(dāng)今這一醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)[1-3]。治療性DNA疫苗的作用機(jī)制是通過產(chǎn)生內(nèi)源性抗原提高機(jī)體特異性細(xì)胞免疫，打破患者免疫耐受狀態(tài)以清除病毒，該種疫苗是穩(wěn)定、安全、有效的理想疫苗之一[4-5]。

基因載體的選擇對(duì)DNA疫苗至關(guān)重要，一方面，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的骨架DNA成分均包括DNA復(fù)制起始位點(diǎn)及抗菌素抵抗基因等，這些成分會(huì)抑制目的基因表達(dá)，并且載體基因DNA可能插入宿主基因組，誘發(fā)插入突變和基因沉默的危險(xiǎn)；另一方面，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低，目的基因只能實(shí)現(xiàn)瞬間表達(dá)，其分子量較大，容易引發(fā)免疫反應(yīng)而被機(jī)體所清除。因此，安全、高效的表達(dá)是研究核酸DNA疫苗基因治療的關(guān)鍵[6]。Chen等[7]和Kay等[8]開發(fā)的微環(huán)DNA載體技術(shù)有助于解決以上問題。微環(huán)是一種環(huán)狀表達(dá)盒子，不含標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒中細(xì)菌骨架DNA，能在體內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)高水平的目的基因產(chǎn)物。微環(huán)在結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)的持久性和細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性等方面與共價(jià)閉環(huán)DNA相同，使微環(huán)成為安全、高效的理想載體之一。微環(huán)DNA的制備方法是將含目的基因的親本質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主菌ZYCY10P3S2T后，以阿拉伯糖誘導(dǎo)重組酶的表達(dá)，重組酶介導(dǎo)其識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生重組，使親本質(zhì)粒重組形成含細(xì)菌骨架的質(zhì)粒和含目的基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA[9]。……