慢性HBV感染者不同病程階段HBV前S基因缺失突變的比較分析

秦雅群，李曉東，廖 昊，李 梵，盧珊珊，劉 妍，徐東平，李 進

我國現有HBV感染者約9300萬人，其中約2000萬人為慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）患者[1]。HBV感染后臨床可表現為急性自限性肝炎、無癥狀 HBV 攜帶、CHB、肝硬化（liver cirrhosis,LC）、慢加急性肝衰竭（acute－on－chronic liver failure,ACLF）和肝細胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）[2]。但是，HBV感染疾病進展的相關機制尚未完全闡明，除受感染年齡影響外，與機體免疫系統和病毒的相互作用密切相關[3]。

HBV為部分環狀雙鏈DNA，其基因組包含了S、P、C和X 4個開放讀碼區。S讀碼區分為前S（pre-S）1基因、pre-S2基因和S基因，各有其起始密碼子，但共用同一終止密碼子。核苷酸（nt）序列分別為 nt 2848-3204、nt 3205-154和 nt 155-835，分別編碼119個pre-S1蛋白、55個pre-S2蛋白及226個S蛋白。pre-S1和pre-S2蛋白包含多個T細胞和B細胞表位，與機體的免疫反應有密切的相互作用[4]。近年來不斷深入的研究發現，pre-S基因的缺失突變可能導致病毒的感染性、分泌能力、免疫原性及抗原抗體的結合能力發生改變。首先，pre-S基因的缺失可能使大蛋白在細胞表達過量，并在細胞中堆積，導致細胞形態的改變，從而加重疾病的進展，多項臨床研究均發現pre-S缺失突變與LC和HCC密切相關[5-7]。其次，HBV感染的決定區域位于pre-S1蛋白N端，通過與肝細胞表面牛磺膽酸共轉運多肽結合以感染肝細胞[8]；pre-S2蛋白包含多聚人血清ALB結合位點，在病毒裝配的過程中起關鍵作用[9]。此外，HBV pre-S基因有SP1和SP2兩個啟動子，其中SP2（nt2809-3152）大部分位于pre-S1基因內，pre-S1缺失突變可影響SP2活性，進而影響中蛋白和小蛋白合成[10]。目前尚缺少針對慢性HBV感染者疾病進展的不同階段進行pre-S基因測序的研究，本研究對較大樣本量的CHB、LC、ACLF和HCC患者進行pre-S基因測序，并比較不同病程階段患者的pre-S缺失發生率以及發生缺失的熱點區域差異，以闡明HBV pre-S1和pre-S2基因缺失突變的臨床流行特點及其各自與疾病進展的關系。

1 對象與方法

1.1 對象 樣本來源于2009年7月—2013年6月在解放軍第三〇二醫院就診的539例乙型肝炎患者，包括CHB患者146例（CHB組），LC患者111例（LC組），ACLF患者 146例（ACLF組），HCC患者136例（HCC組）。診斷按照相應指南進行[11-12]，排除HIV、HDV等混合感染者、酒精性肝病患者及自身免疫性肝病患者。

1.2 方法

1.2.1 HBV DNA的提取 采用綿陽高新區天澤基因工程有限公司生產的DNAout試劑。

1.2.2 HBV pre-S基因的擴增及測序 2輪巢式PCR擴增pre-S基因（nt2848-154）。第1輪擴增的上 游 引 物 為 PSFU1：5'-CCCTCGCCTCGCAGACGAAG-3'；下游引物為 PSFD1：5'-TTGGAGGACAA－

GAGGTTGGTGA-3'。第2輪擴增的上游引物為PSU12：5'-AGCGCCTCATTTTGTGGGTC-3'；下游引物 為 PSD42：5'-TGTAACACGAGCAGGGGTCC-3'。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳（0.7%瓊脂糖、1×Super Buffer，210 V，5min）鑒定后，送北京天一輝遠生物科技有限公司進行DNA序列測定，每個樣品均進行正、反雙向測序。用Vector NTI8.0軟件對序列測定峰圖結果進行比對，并對每個位點的序列峰圖依次進行分析，對正、反雙向測序結果進行比較印證。

1.2.3 pre-S基因缺失突變和缺失熱點區域分析 將測序獲得的序列與NCBI genotyping tool（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpagex.cgi）收錄HBV/C基因型全基因組標準序列的pre-S和S基因相比較（序列號AB014381），鑒定pre-S基因缺失突變。與標準序列相比，pre-S基因發生3個堿基及以上的缺失鑒定為缺失突變。1.2.4 相關指標的檢測 HBV DNA應用實時熒光PCR進行定量測定，檢測儀器為羅氏Light Cycler 480Ⅱ檢測儀。血清HBsAg水平用電化學發光法進行檢測。ALT和TBIL水平采用Olympus AU 5000自動分析儀進行測定。

1.3 統計學處理 采用SPSS 16.0軟件對數據進行統計學分析。定量數據呈正態分布，用x±s表示，缺失片段長度用中位數（最小值，最大值）表示。定量資料組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用q檢驗；多組定性數據比較采用R×Cχ2檢驗，兩兩比較用Scheffe法。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 4組基本臨床資料 4組患者性別組成差異無統計學意義。年齡方面，HCC組高于CHB組（P＜0.05）。血清HBV DNA水平方面，HCC組高于LC組（P＜0.05）。各組ALT水平差異有統計學意義，ACLF組＞CHB組＞LC組＞HCC組。TBIL水平方面，ACLF組顯著高于其他3組，CHB組高于LC組和HCC組（P均＜0.05）。見表1。

2.2 4組pre-S基因缺失率比較 4組患者pre-S基因總體缺失率差異有統計學意義，HCC組和LC組顯著高于CHB組（P＜0.05）；4組pre-S1基因缺失率差異有統計學意義，LC組顯著高于CHB組（P＜0.05）；4組pre-S2基因缺失率差異有統計學意義，HCC組顯著高于CHB組（P＜0.05）。見表2。

2.3 4組S基因缺失熱點區域比較 通過分析不同病程階段患者pre-S基因序列，發現pre-S1基因翻譯起始位置（nt2849-2866）和pre-S2基因翻譯起始位置（nt 5-55）是最常發生缺失的位置；不同病程階段患者缺失發生熱點也不相同（表3）。以CHB組為例，146例CHB患者中有23例發生pre-S總體缺失，其中nt3031-3215和nt24-57為缺失最常發生的區域，各有7例（30.4%）。不同病程階段患者pre-S基因缺失片段長度差異無統計學意義。

表1 4組基本臨床資料比較Table 1 Com parison of clinical data among 4 groups of patients w ith different illness categories

表2 4組pre-S基因缺失率比較［例(%)］Table 2 Comparison of deletion rates of pre-S gene among 4 groups of patients w ith different illness categories[cases(%)]

表3 4組發生缺失突變的熱點區域及缺失片段長度Table 3 Hot spots and fragment lengths of deletion mutation in 4 groups of patients w ith different illness categories

3 討 論

慢性HBV感染者病情的臨床轉歸與病毒、宿主及環境因素密切相關[2]。在感染者體內，HBV核酸成分容易發生變異，引起病毒生物學特點的變化，其結果可導致疾病的慢性化并不斷誘導肝細胞炎性損害，增加產生新的HBV基因變異的機會；同時變異病毒毒力增強和抗原表位發生改變，可能引起過度免疫應答反應，造成嚴重的肝細胞損傷，使得慢性HBV感染者疾病進展[3]。HBV pre-S區是變異最大的區域，易影響機體的免疫反應以及病毒復制力和致病性，從而影響疾病的發生和發展過程。既往研究表明，不同國家及人群的pre-S缺失檢出率存在明顯差異。Chen等[13]研究12個國家pre-S突變流行率，發現中國乙型肝炎患者pre-S缺失檢出率平均為22.4%，日本pre-S缺失檢出率為23%。韓國學者Mun等[14]檢測了120例乙型肝炎不同疾病程度的患者，發現總體pre-S缺失率為30.8%。在本研究中，我國乙型肝炎相關患者的總體缺失率為24.1%，與以往研究結果相似。

一般來講，乙型肝炎患者感染病毒的時間越長，體內越容易積累病毒變異。考慮到我國乙型肝炎患者很多是母嬰垂直傳播，患者的年齡一定程度上可以反應患者的感染時間。本研究中4組患者的年齡總體上有差異，但兩兩比較的結果顯示僅HCC組患者的年齡高于CHB組患者，LC組和ACLF組與CHB組相比并無差別；本研究的病例樣本較大，可在一定程度上平衡年齡差別帶來的病毒變異差異，后續工作中我們將進行進一步的配對分層比較。

目前公認pre-S基因缺失與LC和HCC都有密切關系，但pre-S1和pre-S2基因缺失各自的臨床意義卻存在爭議。pre-S1和pre-S2基因包含的功能區域不一樣，因此缺失引起疾病進展的模式也可能存在差異。pre-S1基因涵蓋位點多為與病毒生活周期相關的位點，包含與宿主受體結合的功能域；而pre-S2基因涵蓋大量的T細胞和B細胞表位，對免疫壓力的反應更活躍[7]。一般認為pre-S2缺失突變是HCC的高風險因素，有研究顯示pre-S2缺失突變可能使得大蛋白、中蛋白和小蛋白比例失調，大蛋白在肝細胞內質網上過量產生和滯留，增加了內質網壓力，導致宿主基因不穩定，增加DNA損傷和基因突變頻率，造成肝細胞進一步損傷及 HCC 的發生[7，15-16]。但也有 Mun等[14]研究發現pre-S1缺失突變更常出現在HCC患者中，而pre-S2缺失突變則更常在LC患者中檢測到，破壞pre-S1起始密碼的缺失突變在HCC進展中起重要作用。本研究結果顯示，LC患者pre-S1基因缺失率顯著高于CHB患者，而HCC患者pre-S2缺失率則顯著高于CHB患者，與多數研究的共識一致。該結果提示pre-S1和pre-S2基因缺失突變的致病機制存在差異，pre-S1基因缺失突變與LC更為相關，而pre-S2基因缺失突變則可能參與了HCC癌變進程。

既往研究中pre-S基因任意片段和任意位置的缺失都統稱為pre-S基因缺失突變，較少將pre-S缺失的位置和缺失片段長度與疾病進展關聯起來。本研究較為系統地比較了不同病程階段患者的缺失發生熱點區域和缺失片段長度的差異。結果發現4組患者發生缺失的熱點區域各不相同：CHB患者的缺失突變多發生在pre-S1蛋白C末端，LC和ACLF患者多發生在pre-S1蛋白的翻譯起始端（N端），HCC患者則多發生在pre-S2蛋白的翻譯起始位置。這種缺失位點的差異可能與pre-S1和pre-S2蛋白所承擔的不同功能相關。此外，4組患者的缺失片段長度的差異無統計學意義，該結果提示缺失長度可能與疾病進展并無直接關系。

綜上所述，本研究根據患者不同病程階段，分組分析了較大樣本量慢性HBV感染者pre-S基因缺失突變的臨床檢出率及其臨床意義，發現慢性HBV感染者中，隨著疾病進展pre-S基因缺失率呈上升趨勢，其中pre-S1基因缺失突變與LC更為相關，而pre-S2基因缺失突變則可能參與了肝臟癌變進程。pre-S基因缺失突變熱點區域為pre-S1和pre-S2基因的翻譯起始位置。此外，pre-S基因缺失的片段長度可能并不影響疾病進展，但pre-S基因缺失的位置則可能對疾病進展產生影響。pre-S1和pre-S2缺失突變在LC和HCC發生和發展過程中的作用機制還有待進一步研究闡明。

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