基于E基因的豬乙型腦炎病毒一步法RT-PCR快速檢測方法的建立和應用

李天芝，于新友，莫 玲，沈志強，

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256600)

日本腦炎病毒(JEV)又稱乙型腦炎病毒，屬于黃病毒科，黃病毒屬，所引起的疾病稱為日本腦炎(JE)或乙型腦炎，是一種人畜共患的自然疫源性傳染病[1]。該病毒主要通過蚊蟲叮咬傳播[2]，豬是其主要傳染來源和擴散宿主，可導致妊娠母豬流產、產死胎或弱仔，公豬睪丸炎，育肥豬持續高熱，新生仔豬呈神經癥狀等，給養豬業造成巨大的經濟損失[3]。該病毒的基因組為單股正鏈RNA，全長約11kb，由3個結構基因(C、preM/M、E)和7個非結構基因(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)構成，其中E基因編碼囊膜糖蛋白是主要的結構蛋白，也是病毒粒子表面最重要的成分，它與病毒粒子的吸附、穿入、致病和誘導宿主的免疫應答等密切相關[4]。目前，JEV診斷方法主要有病毒分離鑒定[5]、免疫細胞化學法[6]、反向被動血凝試驗[7]、免疫熒光試驗(IFA)[8]、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)[9]、熒光定量RT-PCR方法[10]、RT-LAMP方法[11]、常規RTPCR方法[12]等，有的操作繁瑣，診斷時間長，結果重復性不好，有的難以檢測出微量病毒，不適宜疾病早期診斷，有的對儀器要求太高不適合大規模推廣應用，還有的太敏感容易導致假陽性結果。常規RT-PCR操作煩瑣，時間長，有時影響檢測結果的準確性；一步法RT-PCR檢測方法具有特異、敏感、簡便等諸多優點，能在數小時內檢出病原。因此，建立一種快速、簡單、敏感的JEV一步法RT-PCR檢測方法十分必要。筆者根據GenBank公布JEV（GQ495005），針對具有很高保守性的E基因設計1對特異性引物，建立了一種特異、敏感的JEV一步法RT-PCR檢測方法，旨在為JE的早期診斷、流行病學調查等提供一種有效的分子生物學檢測方法。

1 材料和方法

1.1 病毒株與病料

豬乙型腦炎病毒（JEV）、豬藍耳病病毒（PRRSV）、豬圓環病毒2型（PCV 2）、豬細小病毒(PPV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬瘟病毒（CSFV）由山東省濱州畜牧獸醫研究院預防獸醫學與動物生物技術重點開放實驗室保存，臨床檢測病料為2010年3月—2014年12月采自山東省各地豬場臨床診斷為JEV感染的豬的腦、肝臟、脾臟等。

1.2 工具酶及試劑盒

pMD18-T載體、限制性內切酶、PCR相關試劑、DNAMarker、DNA凝膠回收試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司，AxyPrep體液病毒DNA/ RNA小量試劑盒購自愛思進生物技術(杭州)有限公司。

1.3 RT-PCR引物設計與合成

應 用PrimerPrem ier5.0基 因分析軟件，參照GenBank中登錄的JEVE基因序列（GQ495005）設計1對引物，擴增JEVE基因片段大小為513bp，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。上游引物：5'-GGTGCCAGAAGCAGACAG-3'，下游引物：5'-CTCCTTGGCTCACAGTCCAG-3'。

1.4 病毒基因組RNA的提取

按AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒使用說明書提取JEV的RNA，并提取其他幾種病毒的核酸。

1.5 JEVE基因的一步法RT-PCR擴增及條件優化

以RNA為模板進行一步法RTPCR擴增，反應體系為25μL。各參數為50℃逆轉錄30m in，95℃預變性2m in，然后進入95℃30S、54℃30S、72℃30S循環，共40個循環，最后72℃延伸10m in。取5μL產物，1.5%瓊脂糖凝膠電泳。同時對各擴增條件進行優化，包括退火溫度(48～60℃梯度溫度，每2℃為1個梯度)、引物濃度(0.2～1.2μmol/L，每0.2μmol/L為1個梯度)等，反應體系均為25μL。

1.6 PCR擴增產物的檢測及鑒定

首先取擴增產物5μL在1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳，利用凝膠成像系統掃描進行初步鑒定。然后用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。將目的片段與pMD18-T克隆載體于16℃過夜連接，轉化感受態菌株DH 5α。挑取單個的轉化菌落，加LB溶液培養20h后，用質粒提取試劑盒抽提質粒DNA用PCR方法進行鑒定，將陽性克隆送上海生工生物工程股份有限公司進行測序鑒定。將測序結果與參照的JEV序列同源性比較。

1.7 特異性試驗

分別提取JEV、PRRSV、PCV 2、PPV、PRV、CSFV的核酸，用已建立的方法進行擴增。

1.8 敏感性試驗

JEV病毒提取RNA后定量，然后10倍梯度稀釋提取的病毒基因組RNA，使其分別相當于含有100ngRNA、10ngRNA、1ngRNA、100pgRNA、10pgRNA、1pgRNA的含量，分別進行一步法RT-PCR檢測，確定其敏感性。

1.9 重復性試驗

用建立的一步法RT-PCR檢測方法，對PRRSV、PCV 2、PPV、PRV、CSFV、健康豬腸道組織及JEV5份陽性病料和5份陰性病料，重復檢測3次，以驗證本方法的重復性和穩定性。

1.10 臨床樣品的檢測

取疑似送檢病料138份，利用建立的一步法RT-PCR方法進行檢測，對擴增產物全部進行測序鑒定，并利用生物學軟件BLAST進行序列分析。

2 結果與分析

2.1 擴增產物的檢測及鑒定

2.1.1 擴增產物的檢測PCR擴增

產物經過1.2%瓊脂糖凝膠電泳，擴增產物在513bp處可見特異性擴增條帶，與預期大小相符（圖1）。

2.1.2 擴增產物的測序鑒定 挑取PCR鑒定正確的陽性菌液送上海生工生物工程股份有限公司測序。測序結果表明，插入到T載體的基因片段的核苷酸序列與JEV（登錄號：GQ495005）的序列相似性為100%。

2.2 特異性試驗

利用所設計的引物及所確定的最佳反應條件分別對JEV、PRRSV、 PCV 2、PPV、PRV、CSFV的RNA進行一步法RT-PCR。結果6個毒株中只有JEVRNA能擴增出目的片段，大小為513bp(預期為513bp)，而其他毒株均未擴增出相應的片段（圖2）。說明本研究建立的方法特異性強。

2.3 敏感性試驗

圖1 JEV擴增結果

圖2 特異性試驗

圖3 敏感性試驗

取5μ L PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析，分別在約513bp附近出現特異性條帶，與預期產物大小相符。從結果可以看出，引物的一步法RT-PCR檢測靈敏度可以達到10pgRNA（圖3）。

2.4 重復性試驗

經過3次重復操作，結果一致，說明建立的方法是穩定、可靠的。

2.5 臨床樣品的檢測

用建立的JEV一步法RT-PCR檢測方法，共檢測了138份在不同地方采集的豬病料，檢出陽性樣品56份。

3 討論

本試驗根據GenBank公布的JEV保守E基因序列（GQ495005），利用PrimerPrem ier5.0設計1對引物，通過一步法RT-PCR擴增出目的基因，連接到pMD18-T載體，送樣測序，對測序結果與模板序列進行比對，其同源性為100%，對退火溫度優化，發現只有當退火溫度值為54℃時，才能獲得較為理想的產物，即使相差2℃也不能獲得理想的試驗結果。優化引物濃度，在引物濃度為0.2～1.2μmol/ L對PCR擴增效率的影響不大，在0.6μmol/L時擴增效率相對較高，而在1.2μmol/L時擴增效率相對較差。敏感性試驗結果顯示，引物的檢測靈敏度可以達到10pgRNA。特異性試驗結果顯示，本試驗所建立的雙重RT-PCR檢測JEV的方法能夠擴增出513bp目的片段，而對常見的豬病病毒如PRRSV、PCV2、PPV、PRV、CSFV均無擴增產物，證明本方法具有很好的特異性。用建立的JEV一步法RT-PCR檢測方法，共檢測了138份在不同地方采集的豬病料，檢出陽性樣品56份。

本試驗建立的JEV一步法RTPCR檢測方法與傳統的JEV二步法RT-PCR檢測方法相比具有操作簡單，不需要單獨做反轉錄，反轉錄與PCR擴增一步完成，節約了檢測時間。鑒于經費、時間等多方面的原因，筆者僅做了40份JEV病料的一步法RT-PCR檢測方法與傳統的JEV二步法RT-PCR的檢測比對試驗，結果二者的符合率為100%，但能節省檢測時間，更快地指導臨床用藥。JEV一步法RTPCR檢測方法有多種優點如敏感性高、特異性強、快速簡便、檢測成本低，市場應用前景較好。該方法方便、實用，更適合基層獸醫工作者使用。因此本試驗所建立的方法為國內JE的流行病學調查等提供一種實用、有效的分子生物學診斷方法。

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