端粒酶催化亞單位基因誘導人骨髓間充質干細胞的實驗研究

劉新生，許予明

骨髓間充質干細胞MSCs 在神經系統研究中有著廣泛的應用，治療腦血管疾病、老年性癡呆等神經系統疾病的有效途徑之一就是進行干細胞移植。然而，MSCs 的生命周期是有限的，在體外培養20 代后即開始衰老，這一缺陷限制MSCs 在神經系統疾病的進一步研究和應用。建立正常的人骨髓間充質干細胞系是實現應用的前提。本研究將外源性hTERT 轉染至人骨髓間充質干細胞，建立永生化的細胞系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 pCDNA3.1-hTERT 重組質粒由本實驗組構建，轉染試劑Fugene 6(Roche 公司)，淋巴細胞分離液(天津TBD 公司)。鼠抗人CD29、CD44、CD45、CD34 及SV40 單克隆抗體工作液(Santa Cruz 公司)。

1.2 人骨髓間充質干細胞(hMSCs)的提取、培養及鑒定 無菌采集捐獻者的骨髓3 ml，肝素抗凝，與磷酸鹽緩沖液(PBS)等體積混勻，沿液面小心滴加到淋巴細胞分離液上(1∶1)，離心。離心后骨髓分4 層，小心吸取薄膜層，再次離心，洗滌。在光學顯微鏡下記數，常規培養。3 d 后換液，9～11 d 進行首次傳代，后平均7～8 d 傳代一次，進行連續培養。應用細胞表面抗原CD44、CD45、CD29、CD34 對第3 代hMSCs 進行鑒定。

1.3 hMSCs 的轉染及篩選 取第3 代對數生長期的hMSCs，以每空5×105的密度接種到六孔培養板。在無菌Eppendorf 管中按每孔細胞量制備下列溶液:溶液:各7 μg 質粒溶于300 μl 無血清培養基中。將混合液沿壁小心滴加到80%融合的hMSC上，常規培養6 h。48 h 后加新霉素G418 篩選，終濃度為400 μg/ml。第4 天，對照組細胞大部分死亡。利用濾紙片法和有限稀釋法獲得單細胞克隆，擴大培養。

1.4 轉染的傳代細胞鑒定

1.4.1 形態學觀察 倒置顯微鏡每日觀察細胞形態特點、生長特性，選擇有代表性的生長特點攝像。

1.4.2 細胞免疫組化法 取第3 代未轉染細胞及第3 代和34 代轉染后hMSCs，爬片，固定，消除內源性過氧化物酶活性，正常山羊血清封閉，滴加一抗工作液(鼠抗人CD44、CD45、CD29、CD34 及SV40單克隆抗體)，4 ℃過夜，滴加生物素化二抗工作液，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，DAB 避光顯色、脫水、封片。陰性對照用0.01 mol/L 的PBS 代替一抗。

1.4.3 PCR 擴增 提取培養細胞的基因組DNA，以轉染空載體細胞和未轉染細胞做陰性對照，重組質粒做陽性對照。根據hTERT 基因序列設計引物，上游:5’-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3’，下游:5’-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3’。產物為145 bp 片段。反應條件:94 ℃預變性5 min，然后95 ℃30 s，58 ℃45 s，72 ℃60 s，33 個循環，72 ℃延伸7 min。

1.5 細胞系的保存 取生長良好、不同代的轉染后MSCs，消化、終止、離心，凍存液重懸細胞，細胞密度為5×109/L，加入凍存管，逐級降溫，液氮保存。

2 結果

2.1 接種后的24～48 h，體積較大的單個核細胞逐漸貼壁，72 h 后貼壁細胞開始分裂增殖，細胞呈現成纖維細胞梭形外觀。1 w 后，造血細胞基本消失，貼壁細胞體積增大，仍呈梭形，有粗大突起伸出，有些細胞則呈三角形或多角形。2 w 后，細胞融合成單層，梭形突起變長，排列有明顯方向性，細胞排列成漩渦狀、網狀、輻射狀。免疫細胞化學染色后顯示所培養細胞的細胞膜CD29、CD44 有陽性表達，CD34、CD45 呈陰性表達。

2.2 轉染和篩選后獲得一陽性細胞克隆，擴大培養，最終獲得形態學特征單一、穩定的細胞株。轉染后的hMSCs 形態變小，仍以梭形為主，部分呈三角形或多角形，增殖快，平均3～5 d 傳代一次。目前已傳至40 余代(見圖1)。

2.3 細胞免疫組化法結果顯示:第3 代未轉染細胞及第4 代和35 代轉染后MSCs 細胞膜CD29、CD44 有陽性表達，CD34、CD45 呈陰性表達，與原代細胞保持一致。同時也檢測到第4 代和35 代轉染后MSCs 胞內有大量橙色顆粒，hTERT 表達呈陽性反應(見圖2)，表明轉染的細胞穩定表達相應的蛋白質。

2.4 實驗組和陽性對照組擴增出hTERT 特異條帶(見圖3)，而陰性對照組則沒有，表明hTERT基因已穩定整合入轉染細胞的基因組中。

圖1 生長旺盛的第37 代轉染后細胞(×100)

圖2 第35 代轉染后hMSCs-hTERT 表達呈陽性

圖3 實驗組和陽性對照組擴增出hTERT 特異條帶

3 討論

骨髓間充質干細胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)是一群來源于骨髓組織中的非造血細胞，具有自我更新和多向分化潛能，已證實這類細胞在合適的體內外特定條件下可向成骨、軟骨、神經、肌肉、皮膚和肝等多種類型的成熟細胞分化［1～4］，是組織工程中重要的種子細胞。目前MSCs 移植中所用的細胞主要是未經誘導的MSCs，如Brazelton等［5］觀察到在體內條件下，外源性MSCs 在小鼠的體內可以轉變為神經元細胞(表達NeuN、NF 等神經元標志蛋白)。但是Dezawa 等［6］發現將在體外誘導為Schwann 細胞形態特點的MSCs 移入截斷的坐骨神經末端，與移植未誘導的MSCs 相比，使坐骨神經再生更顯著，是否誘導后的MSCs 更有助于神經系統疾病的恢復值得進一步研究。端粒是位于真核染色體末端的具有特殊功能的DNA 帽狀結構，由不含功能基因的簡單重復的非編碼序列和相關蛋白組成，在進化中高度保守。端粒在穩定染色體及防止染色體末端融合等方面具有重要的作用［7］。端粒酶是一種由RNA 和蛋白質組成的核糖核酸蛋白酶，具有逆轉錄活性，不依賴DNA 聚合酶，可以與自身攜帶的RNA 模板合成端粒重復序列。端粒酶由450 bp 的RNA 和至少2 個蛋白亞單位組成，其RNA 是無意義的核酸序列，不編碼蛋白質。端粒酶的活性可以通過調控端粒酶的RNA 成分或(和)蛋白質成分來實現。迄今已有2 個蛋白亞單位被克隆:端粒酶相關蛋白1(TEP1)和人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)。這兩種蛋白組分可對端粒酶活性起到調節作用［8］，尤其是其催化亞單位hTERT(human telomerase reverse transcriptase)，人類端粒酶催化亞單位的活性中心具有與逆轉錄酶相似的結構和功能，作用尤為重要［9］。有研究表明，hTERT 僅存在于端粒酶陽性表達的細胞中，在缺乏端粒酶活性的正常細胞中無表達［10，11］，提示hTERT 是調節端粒酶活性的正調控因子，其表達是端粒酶活性的決定因素和限速步驟。將hTERT 基因導入不表達人端粒酶RNA 和無端粒酶活性的正常體細胞可以有效重建這些細胞中的端粒酶活性。己報道的通過導入hTERT 基因成功獲得永生化的人類細胞有視網膜色素上皮細胞、胎盤細胞、牙組織細胞、神經祖細胞、包皮成纖維細胞、血管內皮細胞、骨髓基質細胞、平滑肌細胞和胰腺nestin 陽性細胞等。這些永生化細胞獲得了適應體外生長的條件，且沒有發生表型改變，也沒有致瘤性，其生長、分化等多種生物學特性并未受到影響［12］。

本實驗通過外源性hTERT 基因在人骨髓間充質干細胞的異位表達，誘導MSCs 的端粒酶活性，維持細胞染色體核型的穩定，從而使人骨髓MSCs 的壽命明顯延長，建立了較穩定的細胞系，進而對其生物學特性進行初步研究。該細胞系具備了原代細胞的典型形態特征以及某些生物學功能，可以成為神經系統干細胞移植研究中的理想細胞材料，為其在神經科學領域研究做前期準備。

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