黃芪甲苷對甲基苯丙胺依賴大鼠腦組織中bcl-2、caspase-3 表達的影響

隋 璐，李新新，劉 坤，沈 薇，郝 偉，趙春瑩

以甲基苯丙胺(methamphetamine，MA)為代表的苯丙胺類中樞興奮劑的長期濫用在世界各地呈上升趨勢，MA 可導致哺乳動物大腦的損傷，目前的研究結果顯示，多種機制參與了MA 對神經元的毒性作用，而MA 通過細胞凋亡機制的激活導致中樞神經系統神經病理和行為的變化是神經毒性損傷的重要機制之一［1］。黃芪甲苷(Astragaloside Ⅳ)是黃芪藥理活性的主要物質，廣泛用于心血管疾病的治療中，可改善心血管的收縮性，起到保護血管內皮細胞的作用［2］。前期的實驗結果表明［3］，黃芪甲苷對神經細胞有保護作用，并推測這種保護作用可能與其抑制氧化應激及減少神經細胞凋亡有關。本實驗通過建立甲基苯丙胺依賴大鼠動物模型，觀察黃芪甲苷對凋亡信號傳導分子caspase-3 及凋亡抑制基因bcl-2 表達的影響，探討黃芪甲苷對甲基苯丙胺依賴大鼠腦細胞凋亡的保護作用，為甲基苯丙胺依賴的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動 物 健康Wistar 雄性大鼠60 只，體重220～250 g，購自沈陽醫學院實驗動物研究中心［許可證號:SCXK(遼2010-0001)］。

1.2 藥品及試劑 甲基苯丙胺由丹東市公安局法醫中心提供(純度78%);黃芪甲苷購于成都康邦生物科技有限公司(純度≥98%，產品批號:120802);兔抗鼠bcl-2 及caspase-3 多克隆抗體購自齊安生物制藥有限公司;DAB 顯色試劑盒、SABC 免疫組化試劑盒均購自武漢博士得生物制劑有限公司;逆轉錄試劑盒購自Superscrip 公司;引物、DNAmarker 由南京金斯特生物公司。

1.3 動物分組、造模及給藥 實驗前將Wistar大鼠在恒溫恒濕的飼養室適應性喂養7 d，自由飲水進食。飼養結束后將60 只大鼠隨機分成4 組，每組15 只。分別為A 組:空白對照組;B 組:MA 依賴模型組;C 組:黃芪甲苷(10 mg/kg)+MA 干預組;D組:黃芪甲苷(20 mg/kg)+MA 干預組。MA 依賴組造模方法參照文獻［4］:MA 腹腔注射，逐日劑量遞增(0.5、1、2、8、10、15 和20 mg/kg)，每天兩次(8:00，20:00)給藥，1 w 后開始維持20 mg/kg 的劑量，連續給藥14 d;黃芪甲苷+MA 干預組在造模的同時每天一次黃芪甲苷灌胃給藥干預治療，黃芪甲苷的劑量分別為10 mg/kg、20 mg/kg;空白對照組腹腔注射等量生理鹽水代替MA。

1.4 免疫組化法檢測大鼠腦組織bcl-2、caspase-3 蛋白的表達 證實模型組大鼠對甲基苯丙胺形成藥物依賴后［5］，進行實驗取材。將各組大鼠用10%水合氯醛0.3 ml/100 mg 腹腔麻醉，迅速斷頭取全腦，沿矢狀縫切取一半腦組織，置于4%多聚甲醛溶液固定24 h，在大腦半球距離中央溝前2 cm間取額葉腦組織，30%蔗糖脫水，石蠟包埋，冠狀連續切片厚5 μm，嚴格按照SABC 免疫組化法試劑盒說明操作，檢測bcl-2、caspase-3 表達水平。在神經元細胞質內出現棕黃色染色顆粒為bcl-2 與caspase-3 蛋白表達陽性細胞。結果用Motic Images Advanced 3.2 圖像分析系統采集照片，并進行定量分析。

1.5 Bcl-2 與caspase-3 mRNA 檢測 按照Trizol 試劑盒說明書提取腦組織RNA，并用primer5 引物設計軟件設計。大鼠bcl-2:F5’-GTCCCGCCTCTTCACCTT-3’，R5’-CCCACTCGTAGCCCCTCT-3’(產物為407 bp)。大鼠caspase-3:F5’-ACG GTA CGC GAA GAA AAG TGAC-3’，R 5’-CCT TCC TGG GCA TGG AGT CCTG-3’(產物為282 bp)。大鼠β-action:F5’-GTGGGGCGCCCAGGCACCA-3’，R 5’-GCTCGGCCGTGGTGGTGAAGC-3’(產物為493 bp)，逆轉錄體系按照Super scripⅡcDNA 合成試劑盒說明。合成的cDNA 于-20 ℃保存備用。聚合酶鏈式反應PCR:cDNA2 μl，dNTP2 μl，10×RT buffer 6 μl，正反義引物(25 mmol/L)各 1 μl，β-actin(25 μmol/L)各1 μl，Tap 酶0.4 μl，加去離子水至25 μl。反應參數95 ℃5 min;95 ℃30 s;55 ℃30 s;72 ℃30 s;30 個循環;最后72 ℃延伸10 min。PCR 產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測，Tanon-2500R 凝膠圖像處理系統進行拍照掃描分析。實驗重復3 次。

1.6 統計學方法 采用SPSS16.0 統計軟件對實驗數據進行單因素方差分析，計量資料用均數±標準差(±s)表示，兩兩均數的比較采用t 檢驗，均以P＜0.05 為有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化檢測bcl-2、caspase-3 蛋白的表達 空白對照組bcl-2 陽性細胞呈少量表達;MA 依賴模型組bcl-2 陽性細胞表達增多，部位主要分布于額葉皮質，與空白對照組相比，有顯著性差異(P＜0.01)。黃芪甲苷(20 mg/kg)治療組bcl-2 陽性細胞表達明顯增加，與MA 依賴模型組相比，差異有顯著性(P＜0.01);而黃芪甲苷(10 mg/kg)治療組bcl-2 陽性細胞表達增加不明顯，與MA 依賴模型組相比，無顯著性差異(P＞0.05)。空白對照組可見caspase-3 陽性細胞呈少量表達;MA 依賴模型組caspase-3 陽性細胞表達增多，部位主要分布于額葉皮質，與空白對照組相比，有顯著性差異(P＜0.01)。黃芪甲苷(20 mg/kg)治療組caspase-3 陽性細胞表達明顯減少，與MA 依賴模型組相比，差異有顯著性(P＜0.01);而黃芪甲苷(10 mg/kg)治療組caspase-3 陽性細胞表達降低不明顯，與MA 依賴模型組相比，無顯著性差異(P＞0.05)(見表1)，結果(見圖1)。

2.2 各組大鼠腦組織中bcl-2、caspase-3 mRNA表達的影響 模型組大鼠腦組織的bcl-2 mRNA、caspase-3 mRNA 表達增多，與空白對照組比較均有顯著性差異(P＜0.01);黃芪甲苷各劑量治療組大鼠腦組織的bcl-2 mRNA 表達增加、caspase-3 mRNA表達明顯減少，二者高劑量治療組與模型組比較均有顯著性差異(P＜0.01);但低劑量治療組的作用不如高劑量組，與模型組比較均無顯著性差異(P＞0.05)(見表2)，結果(見圖2)。

表1 各組大鼠腦組織bcl-2、caspase-3 蛋白表達的比較(±s，n=15)

表1 各組大鼠腦組織bcl-2、caspase-3 蛋白表達的比較(±s，n=15)

與空白組比較* P＜0.01;與MA 依賴模型組相比較△P＜0.01

表2 黃芪甲苷對MA 依賴大鼠腦組織bcl-2、caspase-3 mRNA 表達的影響(±s，n=15)

表2 黃芪甲苷對MA 依賴大鼠腦組織bcl-2、caspase-3 mRNA 表達的影響(±s，n=15)

與空白組比較* P＜0.01;與MA 依賴模型組相比較△P＜0.01

圖1 各組大鼠腦組織bcl-2 蛋白表達免疫組化(×400)

圖2 各組大鼠腦組織caspase-3 蛋白免疫組化(×400)

3 討論

目前研究已表明，神經細胞凋亡是甲基苯丙胺神經毒性作用中的分子機制之一，而凋亡相關基因bcl-2 和caspase-3 蛋白在MA 中毒后的表達異常也說明了這兩種蛋白參與了MA 誘導神經細胞發生凋亡的機制。MA 是一種帶正電荷的脂溶性分子，進入線粒體后容易潴留其中，破壞ATP 酶的活性和線粒體膜的完整性，從而導致線粒體功能紊亂，繼而啟動caspase 級 聯反應，誘發神經細胞凋亡［6］。caspase-3 屬于半胱氨酸蛋白酶，是最為關鍵的凋亡執行者，在凋亡的級聯反應中起到樞紐作用［7，8］。bcl-2 是一種強有力的凋亡抑制基因，bcl-2 可通過穩定線粒體膜、阻止caspase-3 激活的作用抑制細胞凋亡，從而對神經細胞起到保護作用［9］。

本研究結果顯示，MA 依賴模型組大鼠的腦組織bcl-2 蛋白表達和bcl-2 mRNA 表達明顯增加，可能是機體對抗凋亡所做出的一種應激反應。黃芪甲苷治療組大鼠腦組織的bcl-2 表達高于MA 依賴模型組，提示黃芪甲苷干預治療可使受損傷的腦組織bcl-2 蛋白表達進一步上調，但通過何種途徑上調bcl-2 表達，還有待于進一步研究。而caspase-3 蛋白和caspase-3 mRNA 在MA 依賴模型組大鼠的腦組織表達增多，說明損傷刺激引發了caspase 級聯反應，細胞凋亡增加。在黃芪甲苷治療組大鼠腦組織的表達減少，提示黃芪甲苷可通過降低caspase-3 蛋白的表達和活化，抑制MA 誘發的神經細胞凋亡，從而對神經細胞起到保護作用。

黃芪甲苷(Astragaloside Ⅳ)是從豆科草本植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根中提取、分離得到的單一成分，是中藥黃芪的指標性成分，具有提高機體免疫力、保護腦組織等作用［2］。本實驗研究結果顯示，黃芪甲苷可抑制腦細胞凋亡，其抗凋亡作用的機制可能是通過抑制凋亡始動因子caspase-3 并通過上調抑制凋亡基因bcl-2 蛋白的表達來實現的。且本實驗結果也提示了黃芪甲苷具有劑量依賴性，大劑量組的黃芪甲苷才有抑制腦細胞凋亡的作用。

［1］Huang YN，Wang JY，Lee CT，et al.Ascorbate attenuates methamphetamine neurotoxicity through enhancing the induction of endogenous heme oxygenase［J］.Toxicology and Applied Pharmacology，2012，265(2):241-252.

［2］Li XH，Wang HX.Effect of astragaloside IV in cardiovascular disease［J］.Adv Cardi ov Dis(心血管病學進展)，2011，32(1):132-136.

［3］隋 璐，劉 坤，沈 薇，等.黃芪甲苷對甲基苯丙胺依賴大鼠腦組織中NO、SOD 和MDA 的影響［J］.中國當代醫藥，2014，21(26):16-18.

［4］李新新，楊秀麗，陳曉雷，等.Caspase-3 抑制藥對甲基苯丙胺依賴大鼠腦組織NO 和SOD 及MDA 的影響［J］.醫藥導報，2014，33(4):426-428.

［5］張麗華，張東宣，志 恒，等.建立大鼠甲基苯丙胺的神經精神毒性模型［J］.中國藥物依賴性雜志，2013，22(2):95-97.

［6］李新新，李 輝，陳曉雷，等.z-DEVD-fmk 干預甲基苯丙胺依賴大鼠腦細胞凋亡與bcl-2 蛋白的表達［J］.中國醫科大學學報，2013，42(8):730-733.

［7］Chaudhry P，Singh M，Parent S，et al.Prostate apoptosis response 4(Par-4)，a novel substrate of caspase-3 during apoptosis activation［J］.Molecular and Celluar Biology，2012，32(4):826-839.

［8］Vecran F，Boidoy R，Solary E，et al.A short caspase-3 isoform inhibits chemotherapy-induced apoptosis by blocking apotosome assembly［J］.Plos One，2011，6(12):29058-29065.

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