梗死后血管性認知障礙與血清胱抑素C 及APOE 基因多態性的關系

劉健偉，王 雁，隋愛華

VCI 是指由血管或血管的危險因素引起的認知功能障礙的一類綜合征［1］，包括VCIND(血管性認知功能障礙非癡呆型)、VaD(血管性癡呆)和混合性癡呆(阿爾茨海默病和VaD)等不同程度及類型的認知障礙，其意義在于對早期認知功能下降患者的診斷及干預。隨著我國老年人口的不斷增加，血管性認知障礙的發病人數也越來越多，已有的研究表明APOEε4 基因與VCI 的發病相關。Chuo［2］曾報道血清胱抑素C 水平與認知功能存在聯系，而目前胱抑素C 及APOE 基因多態性與VCI 的研究少見，為探索之間的關系，我們進行了以下的研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013 年1 月-2014 年7月在我院神經內科住院的腦梗死患者218 例，均為山東漢族人，腦梗死入組的診斷均符合1995 年全國第四屆腦血管病學術會議通過的診斷標準，經頭部CT 或MRI 檢查證實有梗死病灶。包括:(1)腦梗死后VCI 組110 例，其中男性58 例，女性52 例，入組者均符合DSM-IV 癡呆的診斷標準;MoCA 量表評分＜26 分，受教育年限＜12 y 的患者再加1 分;Hachinsk 缺血指數(HIS)≥7 分，HAMD 評分＜7分;所用量表評分分值均由至少2 名神經內科專科醫師確認［3］;(2)腦梗死后認知功能正常組108 例，其中男性53 例，女性55 例，入選者無認知功能減退，MoCA 量表評分≥26 分，受教育年限＜12 y 的患者再加1 分。兩組患者腦梗死嚴重程度、治療時間、性別、年齡等一般情況差異無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。兩組的排除標準:除外視、聽、說障礙而不能配合檢查者的患者;除腦梗死外其它腦部疾病或系統疾病所致認知障礙;患有嚴重心肝腎等重大疾病患者。

1.2 方 法

1.2.1 樣本收集和處理 提取研究對象10 ml空腹靜脈血分A、B 兩管裝，A 管聚丙烯EDTA 抗凝，按常規方法提取白細胞基因組DNA，-20 ℃低溫保存;B 管離心分離血清，應用免疫比濁法在2 h 內測定Cys C 水平，正常參考值范圍0.54～1.55 mg/L。

1.2.2 基因型檢測 APOE 基因多態性檢測，引物設計參照文獻［4］，反應條件:95 ℃預變性3 min，95 ℃30 s，61 ℃30 s，72 ℃1 min，共35 個循環，72 ℃延伸5 min。

1.2.3 DNA 序列測定 將PCR 產物用5%瓊脂糖凝膠電泳半小時后拍照觀察結果，并將產物純化，送至上海生工測序。

1.3 統計方法 所有數據應用SPSS17.0 統計軟件進行處理，正態分布的計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用兩個獨立樣本t 檢驗，組間計數資料比較采用χ2檢驗，Hardy-Weinberg 平衡檢驗觀察樣本是否具有群體代表性。

2 結果

2.1 一般資料的比較 兩組人群性別、年齡匹配、高血壓病史、糖尿病史、TG、TC、LDL、HDL、吸煙史、飲酒史組間相比差異無統計學意義(P＞0.05)(見表1)。

2.2 基因測序及分析 兩組APOE 多態性位點基因型頻率的分布均符合Hardy-Weinberg 平衡(P＞0.05)。APOE 經PCR 擴增后電泳，產生大小為227 bp 的片段(見圖1)。APOE 第112 位點精氨酸與第158 位點半胱氨酸產生3 種等位基因ε2、ε3、ε4 和6 種基因型，ε2/2、ε3/3、ε4/4 3 種純合子和ε2/3、ε2/4、ε3/4 3 種雜合子，測序圖(見圖2、圖3)，112 位點與158 位點密碼子序列(見表2)。

2.3 APOE 基因型及等位基因分布 VCI 組與CIND 組APOEε4 等位基因頻率分別為21.4%和13.0%，VCIε4 基因攜帶組與CINDε4 基因攜帶組比較存在統計學差異(P=0.033)(見表3)。

2.4 胱抑素C 血清濃度分析及比較 VCI 組患者血清胱抑素濃度(1.11±0.27)mg/L 高于CIND 組血清濃度(0.97±0.33)mg/L，經統計學檢驗有意義(P=0.012);而VCIε4 基因非攜帶組患者血清胱抑素濃度(1.07±0.29)mg/L 雖略高于CIND 組，但仍存在統計學差異(P=0.026);VCI 組中ε4 基因攜帶組血清濃度(1.24±0.23)mg/L 明顯高于ε4 基因非攜帶，且兩者的差異有統計學意義(P=0.035)(見表4)。

表1 兩組一般資料的比較

表2 不同基因型112、158 位密碼子序列

表3 兩組APOE 基因型及等位基因頻率分布

圖1 APOE 基因PCR 擴增圖Marker 大小為600 bp

圖2 APOE158 位點測序圖

圖3 APOE112 位點測序圖

表4 各組血清抑素C 水平比較

3 討論

VCI 是指由血管或血管相關因素引起的認知功能障礙［5］，因對VCI 進行早期干預可以延緩病程進展，故對其發病機制及影響因素的研究越來越多［6］。目前除了血管損害，遺傳因素也逐漸重視起來。ApoEε4 基因、notch3 基因是目前已被證實的VCI 潛在的致病基因。我們的研究發現VCI 組APOEε4 等位基因頻率高于對照組，并存在統計學差異，與前述結論較為一致，提示在山東漢族人群中，APOEε4 基因攜帶可能增加VCI 的發病風險。胱抑素C 又稱半胱氨酸蛋白酶抑制劑C，是一種低分子量的非糖基化堿性蛋白質，廣泛存在于體液及各種組織的有核細胞中，參與細胞內外蛋白水解酶的調控，保護細胞免受不適當的內源性或外源性蛋白酶水解，是目前發現對組織蛋白酶B 抑制作用最強的物質［7］。自1961 年Clausen 從腦脊液中首次發現后，研究者對胱抑素C 的生物學作用逐漸重視起來。新近有報道稱血清高胱抑素C 水平可能是阿爾茨海默病和輕度認知障礙的危險因素［8］。Levy E 的研究也證實，胱抑素C 基因68 位點處發生基因突變(A/G)與遺傳性淀粉樣血管病(HCCAA)的發病相關［9］。Yaffe［10］等認為血清CysC 水平可作為反映老年人認知功能的標志物之一，國內羅鑭等［11］報道稱糖尿病患者的血清CysC 水平能增加2 型糖尿病患者輕度認知功能損害，王大力［12］也曾報道稱血清胱抑素C 水平升高是梗死后VCI 的危險因素。這些研究報道從各方面說明了胱抑素C 與認知障礙具有相關性。有研究表明胱抑素C 對腦梗死的發病具有保護作用［13］，但更多的研究更傾向胱抑素C 與腦梗死的發病相關［14］，并提出血清胱抑素C 可能是腦梗死的獨立危險因素的觀點，而腦梗死是VCI 最主要的血管影響因素。我們將實驗研究對象定為梗死后VCI 人群，發現梗死后VCI 組患者血清胱抑素C 濃度高于對照組且兩組的差異有統計學意義，提示山東漢族人血清胱抑素C 水平可作為提示梗死后VCI 早期發病的臨床檢測指標之一。

近年研究表明，血清胱抑素C 的表達失衡是動脈粥樣硬化發生、發展的重要原因之一，而動脈粥樣硬化可通過多種機制作用增加認知障礙的發病風險［15］。人類ApoEε4 等位基因能增加膽固醇含量，促進動脈粥樣硬化形成，引起腦組織缺血、缺氧壞死，導致VCI 的發生。據上可知，胱抑素C 與APOEε4 基因兩者均能通過促進動脈粥樣硬化的發病來增加VCI 的風險。我們對VCI 組APOEε4 基因攜帶者與APOEε4 基因非攜者進行對比，發現VCI伴APOEε4 基因攜帶者血清胱抑素C 濃度明顯高于VCI 組APOEε4 基因非攜者，且兩者的差異有統計學意義，說明血清胱抑素C 水平升高可提示梗死后VCI 伴APOEε4 基因攜的患者有早期發病的風險，胱抑素C 水平的檢測可為梗死后VCI 患者的臨床早期診斷提供依據。

據上可以得出，血清中胱抑素C 水平增高，尤其APOEε4 基因攜帶患者的血清胱抑素C 水平的增高可以作為梗死后VCI 的早期診斷依據。但本研究病例數較少，且未對胱抑素C 水平的影響因素進行分析，有待進一步擴大樣本量進行多中心聯合研究，進一步明確具體機制，為早期干預VCI 的發生創造條件。

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