載脂蛋白E 對EAE 星形膠質細胞的影響

楊程程，韋俊杰，唐玉蘭，鄭明華，韋云飛

多發性硬化(Multiple Sclerosis，MS)是以中樞神經系統(CNS)慢性炎性脫髓鞘為主要特征的自身免疫性疾病。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是研究MS 常用的動物模型。我們之前的研究發現，載脂蛋白E(apolipoprotein E，apoE)可以減輕EAE 髓鞘和軸突的損傷［1］，抑制Th1 和Th17 細胞的免疫應答［2］，下調CD4+T 細胞的表達［3］，對EAE 小鼠有神經保護作用。水通道蛋白4(aquaporins 4，AQP4)和膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acdic protein，GFAP)均表達于CNS 星形膠質細胞，與星形膠質細胞水腫、增生有關，但apoE 對EAE 小鼠星形膠質細胞AQP4、GFAP 的表達是否有影響?作用機制如何?目前尚未見相關報道。本研究采用apoE基因敲除的C57BL/6 小鼠及野生型C57BL/6 小鼠建立EAE 模型，對神經功能缺損情況進行評分，觀察大腦、脊髓病理改變及AQP4、GFAP 的表達，從而探索apoE 對EAE 病灶星形膠質細胞的作用及其機制，以期為MS 的治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 標準化飼養的6～8 w 雌性的apoE 基因敲除C57BL/6 小鼠及野生型C57BL/6 小鼠，體重18～20 g，北京華阜康生物科技股份有限公司提供。20 只野生型C57BL/6 小鼠隨機分成普通EAE 組及正常對照組，每組各10 只;10只apoE 基因敲除小鼠作為apoE-/-EAE 組。

1.1.2 主要試劑 髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(MOG35-55，純度＞95%，上海生工生物工程有限公司);百日咳毒素(PTX)、完全弗氏佐劑(CFA)(Sigma 公司);卡介苗(Difco 公司);兔抗小鼠AQP4 多克隆抗體(武漢博士德有限公司);兔抗小鼠GFAP多克隆抗體、SP 法免疫組化試劑盒、DAB 顯色試劑盒(北京中杉金橋有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 制備完全抗原及建立EAE 模型 用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液將MOG35-55 稀釋成2 mg/ml，與等量含6 mg/ml 卡介苗的CFA 充分混合，全玻璃注射器抽打至呈油包水乳狀，制成完全抗原。普通EAE 組及apoE-/-EAE 組分別于小鼠背部皮下多點注射完全抗原0.2 ml/只，正常對照組以等量生理鹽水代替。免疫當天為0 d，分別于0、2 d給apoE-/-EAE 組及普通EAE 組小鼠腹腔注射PTX0.5 g/次。

1.2.2 神經功能缺損評分 免疫后每天上午由同一人對小鼠進行神經功能缺損評分，測量體重并記錄。采用7 分評分法。0 分:不發病;1 分:尾巴半癱;2 分:尾巴全癱;3 分:步態異常;4 分:后肢輕癱;5 分:后肢重癱;6 分:前肢受累;7 分:瀕死或死亡。

1.2.3 解剖及病理染色 免疫誘導后35 d，麻醉小鼠，經左心室插管灌注生理鹽水，繼以4%多聚甲醛緩沖液灌注。斷頭，分離大腦和脊髓，4%多聚甲醛4℃中固定24 h，逐級予乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，連續切片4 μm，行HE 染色，觀察病理學變化。

1.2.4 免疫組化 取上述蠟塊行4 μm 連續切片，按SP 法免疫組化試劑盒說明書操作，顯微鏡下觀察大腦和脊髓AQP4、GFAP 的表達，陰性對照用PBS 取代一抗。細胞膜或細胞質呈黃色或棕黃色為陽性表達.每只小鼠的大腦和脊髓各取3 張切片，每張切片取互不重復的5 個高倍視野(×200 倍)，應用Image-proplus 6.0 軟件測量每個高倍視野的積分光密度值(IOD)和陽性表達面積(area)，計算平均積分光密度(IOD/area)。

1.2.5 統計學方法 采用SPSS 16.0 統計軟件分析數據，正態計量資料以±s 表示，非正態計量資料以組中值(M)和95%可信區間(95%CI)表示;兩個獨立樣本均數的比較用成組t 檢驗，多組間均數的比較用單因素方差分析，組間差異用SNK 檢驗(方差齊時)或Games-Howell 檢驗(方差不齊時)，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 發病情況 apoE-/-EAE 組和普通EAE 組于免疫后11 d 相繼發病，癥狀隨時間延長而逐漸加重。兩組潛伏期比較無統計學意義(P＞0.05)。臨床功能缺損評分峰值apoE-/-EAE 組顯著高于普通EAE 組(P＜0.05)(見表1)。正常對照組無小鼠發病，活動度正常。

2.2 HE 染色 apoE-/-EAE 組和普通EAE 組小鼠大腦、脊髓的小血管周圍均發現炎性細胞浸潤，典型者呈“袖套樣”改變，其中apoE-/-EAE 組的上述病理學改變明顯重于普通EAE 組(見圖1)。正常對照組大腦和脊髓未見異常。

表1 臨床癥狀觀察(M，95%CI)

表2 AQP4 在小鼠大腦、脊髓中的表達(±s)

表2 AQP4 在小鼠大腦、脊髓中的表達(±s)

與普通EAE 組比較* P＜0.05;與正常對照組比較△P＜0.05

表3 GFAP 在小鼠大腦、脊髓中的表達(±s)

與普通EAE 組比較* P＜0.05;與正常對照組比較△P＜0.05

2.3 各組AQP4 的表達比較 通過免疫組化測定各組織AQP4 的平均積分光密度，發現:apoE-/-EAE 組和普通EAE 組大腦、脊髓中AQP4 的表達量均高于正常對照組，差異均有統計學意義(P＜0.05);apoE-/-EAE 組大腦和脊髓AQP4 表達量均高于普通EAE 組，差異均有統計學意義(P＜0.05)(見表2、圖2)。

2.4 各組GFAP 的表達比較 通過免疫組化測定各組織GFAP 的平均積分光密度，發現:apoE-/-EAE 組和普通EAE 組大腦、脊髓中GFAP 的表達量均高于正常對照組，差異均有統計學意義(P＜0.05);apoE-/-EAE 組大腦和脊髓GFAP 表達量均高于普通EAE 組，差異均有統計學意義(P＜0.05)(見表3、圖3)。

3 討論

星形膠質細胞是神經元的衛星細胞，對神經元起支持作用，參與血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)的形成。apoE 在CNS 主要由星形膠質細胞合成，主要功能是調節CNS 脂類代謝，此外還可以通過下調中樞神經系統炎癥反應、減輕氧化應激等機制，發揮神經保護作用［4］。Chiasserini 等報道，apoE在MS 患者中有不同程度的下降［5］;而且我們前期研究發現，apoE 擬肽可以減輕EAE 的臨床癥狀和炎性浸潤［2］。本研究結果顯示，apoE-/-EAE 組較普通EAE 組神經功能缺損加重，病理檢查可見血管周圍炎性細胞浸潤增多，與國內外報道相符。進一步證明了apoE 缺乏可加重EAE 對小鼠造成的神經功能損害。

AQP4 是水通道蛋白家族的一員，在CNS 表達于星形膠質細胞的足突，主要功能是介導水分子轉運。本研究結果顯示，AQP4 在普通EAE 組的表達較正常對照組顯著增高，與Miyamoto 的報道一致［6］，表明EAE 中存在星形膠質細胞水腫。我們還發現，與普通EAE 組相比，apoE-/-EAE 組中AQP4 表達水平顯著升高，提示apoE 缺乏可以加重EAE 星形膠質細胞水腫。AQP4 有介導水跨膜轉運和促進前炎性細胞因子分泌的特性［7］，而apoE 缺乏造成了AQP4 的表達升高。因此我們推測，高表達的AQP4 一方面通過正反饋調節，促使更多水分子進入星形膠質細胞，使其體積增大、內壓升高，進而形成細胞毒性水腫，甚至導致星形膠質細胞破裂;另一方面也增強了促炎性細胞因子的分泌。加之apoE 缺乏會增加EAE 小鼠基質金屬蛋白酶-9 活性［8］，有可能影響BBB 的功能，這些作用共同加重了EAE 星形膠質細胞的水腫。

GFAP 為星形膠質細胞的骨架蛋白，其表達的高低可反映星形膠質細胞增生及壞死的程度。有研究報道，在MS/EAE 病灶中心和邊緣，有反應性星形膠質細胞聚積［9］。反應性星形膠質細胞在MS/EAE 中發揮雙重作用:雖然它在血管周圍形成瘢痕樣屏障，限制炎癥細胞侵入CNS，但病灶周圍膠質過多，也阻礙了少突膠質細胞遷移至病灶產生新髓鞘;并且小膠質細胞隨之激活，可導致神經細胞二次損傷。可見，膠質細胞過多可惡化EAE 病情。本研究發現，GFAP 在普通EAE 組的表達較正常對照組顯著增高，與國內外報道一致［10］，表明EAE 中有星形膠質細胞增生。我們還發現，與普通EAE 組相比，apoE-/-EAE 組GFAP 表達水平更高，提示apoE缺乏加重了EAE 反應性星形膠質細胞增生，增多的星形膠質細胞易形成膠質瘢痕，惡化EAE 病情。研究表明，低密度脂蛋白受體相關蛋白(LDLR-related protein，LRP)作為apoE 的配體之一，表達于星形膠質細胞的細胞膜，與膠質細胞的激活有關［11］。我們推測，apoE 與星形膠質細胞表面的LRP 結合，直接阻礙其星形膠質細胞增生;apoE 也可能影響了細胞因子的分泌，從而間接抑制反應性星形膠質細胞增殖。另外，AQP4 可以加快星形膠質細胞遷移［6］。我們認為apoE 也可能通過減少AQP4 的生成，使質膜的水通透性減弱，從而阻礙星形膠質細胞的遷移，抑制其在病灶周圍聚集形成膠質瘢痕，改善EAE 病情進展。

本研究結果表明，EAE 中存在星形膠質細胞水腫、增生，apoE 缺乏可以加重EAE 星形膠質細胞的水腫和增生，從而惡化EAE 的病情。因此，本研究的發現可能成為MS 治療的切入點。但由于MS 星形膠質細胞水腫和增生的形成機制復雜，尚需進一步研究。

圖2 D:apoE-/-EAE 組大腦;E:普通EAE 組大腦;F:正常對照組大腦;G:apoE-/-EAE 組脊髓;H:普通EAE 組脊髓;I:正常對照組脊髓(AQP4 免疫組化染色，×400)

圖3 J:apoE-/-EAE 組大腦;K:普通EAE 組大腦;L:正常對照組大腦;M:apoE-/-EAE 組脊髓;N:普通EAE 組脊髓;O:正常對照組脊髓(GFAP 免疫組化染色，×400)

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