腦脈泰對慢性腦缺血大鼠認知功能的保護作用及其機制研究

牟靜靜，孟 星，孟盼盼，張雨晴，孫 莉

中藥腦脈泰是由紅參、三七、當歸、丹參等組成的中藥制劑，具有益氣活血、化瘀通絡之功效。文獻研究證明腦脈泰對慢性腦缺血致血管性癡呆(VD)大鼠的學習記憶具有保護意義，可能通過以下幾個方面的作用機制:(1)提高腦組織中乙酰膽堿的含量;(2)降低VD 大鼠的血液黏度［1］，增加海馬局部腦血流量［2］;(3)減輕炎癥反應，提高腦組織抗氧化能力［3］;(4)抑制海馬區神經細胞凋亡［4］。

腦脈泰對血管性癡呆的保護作用的確切作用機制尚未完全明了。本實驗通過建立2VO 大鼠模型，利用Morris 水迷宮和免疫組化等方法研究慢性腦缺血后大鼠的認知功能、海馬CA1區神經元變化、NGF和GFAP 的表達以及給予中藥腦脈泰后的影響，進一步探討中藥腦脈泰對慢性腦缺血大鼠的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 健康雄性Wistar 大鼠60 只，由吉林大學實驗動物中心提供，體重250～300 g。

1.2 試劑與儀器 中藥腦脈泰為腦脈泰膠囊內容物，由桂林三金藥業提供(批號:130904);兔抗鼠NGF 和兔抗鼠GFAP 購自武漢博士德生物公司(產品編號分別為3574102 和11cm28)，DAB 辣根過氧化物酶顯色試劑盒購自碧云天生物公司(產品編號P0202)。辣根過氧化物酶HRP 標記羊抗兔二抗IgG 購自Jackson ImmunoResearch(產品編號:111-035-003)，動物運動和行為分析系統購自荷蘭NOLDUS 公司(貨號:PS-M)。熒光顯微鏡購自日本(型號OLYMPUS-BX51)。

1.3 實驗分組 所有大鼠適應性飼養1 w 后進行Morris 水迷宮預實驗篩選48 只合格大鼠，隨機分成假手術組、慢性腦缺血模型組、腦脈泰高劑量組、腦脈泰低劑量組，每組各12 只。

1.4 制備動物模型及給藥 采用雙側頸總動脈永久結扎法(2-VO)制備慢性腦缺血模型。大鼠術前12 h 禁食，自由飲水。用10% 水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠。仰臥固定，頸前部去毛消毒后沿頸正中切開，鈍性分離皮下組織，于切口正下方的斜方肌與氣管夾角處可見頸總動脈搏動。分離頸總動脈，以“4”號絲線雙重結扎。術中動作輕柔，避免鉗夾和過分牽拉迷走神經，注意無菌原則。行間斷縫合組織和皮膚。假手術組動物手術過程同模型組，頸總動脈只分離不結扎。術中及術后注意大鼠保暖。術后連續3 d 給予腹腔注射青霉素以消毒傷口及周圍皮膚，防止切口感染。造模術后3 d 至術后45 d 給藥組給予腦脈泰高劑量和低劑量組灌胃，劑量分別為高劑量組2.24g/kg，低劑量組0.56 g/kg，灌胃體積為1.5 ml/只，模型組和假手術組給予相同劑量的生理鹽水，每周稱取大鼠體重調整給藥量。連續灌胃6 w。

1.5 Morris 水迷宮 應用Morris 水迷宮對大鼠進行學習記憶能力的測定。Morris 水迷宮實驗分為兩部分:(1)定位航行實驗:用于測量大鼠對水迷宮學習和記憶的獲取能力。實驗歷時6 d，1 d 讓大鼠自由游泳2 min;從2 d 起，每天下午訓練4 次(每個象限各1 次)。訓練時每個象限隨機選擇一個入水點，將大鼠面向池壁放入水中，系統自動記錄大鼠尋找并爬上平臺時所需時間(逃避潛伏期)及運動軌跡，每次訓練間隔為20 min。如果大鼠在120 s內未找到平臺，須將其引至平臺，這時潛伏期計為120 s。(2)空間搜索實驗:在6 d 第5 次訓練時撤除水下平臺，選擇同一入水點將大鼠面向池壁放入水中，系統自動記錄其在120 s 內跨過原平臺相應位置的次數及持續時間。

1.6 腦組織病理檢測及免疫組織化學測定

1.6.1 腦組織固定 水迷宮實驗結束后，大鼠禁食12 h 以上，10%水合氯醛進行腹腔注射麻醉大鼠。迅速開胸充分暴露胸腔，自心尖插入灌注針頭到主動脈根部，剪掉右心耳，灌注生理鹽水200 ml至流出液體澄清后再灌注4%多聚甲醛200 ml 進行內固定，待大鼠肢體僵硬，肝臟發白，則灌流成功。斷頭取大腦，留取海馬和額葉放入4%多聚甲醛固定24 h 以上。對腦組織標本石蠟包埋后從前往后冠狀位連續切片，每片約5 μm。

1.6.2 蘇木精-伊紅(HE)染色 石蠟切片常規脫蠟:二甲苯(I)、二甲苯(II)各10 min，轉移至100%乙醇(I)、100%乙醇(II)、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各2 min，然后蒸餾水沖洗2 min。蘇木精染色5～10 min，自來水沖洗多余染色液約1～3 s。1%鹽酸乙醇分化1～3 s，自來水沖洗10～15 min。伊紅染色30 s～3 min。常規脫水，經80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇(I)、100%乙醇(II)脫水各1 min，二甲苯(I)、二甲苯(II)透明各1 min，中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.6.3 免疫組織化學染色 NGF 和GFAP 免疫組化染色采用SP 法:常規脫蠟，3%H2O2/甲醇室溫孵育10 min，消除內源性過氧化物酶PBS 漂洗3次，每次5 min。將組織切片置于10 mmol/L、pH6.0的檸檬酸鈉緩沖液中98 ℃左右10～15 min，冷卻后反復1～2 次，自然冷卻30 min。5%BSA 阻斷非特異性抗體，37℃濕盒孵育20 min。滴加一抗，分別為NGF(1∶100)、GFAP(1∶100)，4℃過夜。PBS 漂洗3 次，每次5 min。滴加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗IgG，37℃濕盒孵育40 min。PBS 漂洗3 次，每次5 min。DAB 顯色，蒸餾水充分沖洗。蘇木精復染。酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。鏡下觀察。免疫織化對照組不加一抗，用PBS 代替，其余步驟同前。

1.7 圖像采集和統計學處理 切片在日本OLYMPUS-BX51 顯微鏡下觀察結果，每張切片在高倍鏡下隨機選擇3 個視野，利用Image-Pro plus 6.0 專業圖像分析軟件進行分析，取平均光密度值OD=IOD/area(統計區域內陽性物質的光密度值總量/有效統計區域的面積)。并取其平均值作為該只大鼠測量結果的最終值。數據以±s 表示，所有結果采用SPSS17.0 統計軟件對數據進行處理，組間數據比較采用單因素方差分析，P＜0.05時差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 腦脈泰對慢性腦缺血大鼠學習記憶能力的影響 Morris 水迷宮實驗顯示，在定位航行試驗中，模型組與假手術組相比，隨著訓練次數的增加，兩組之間差異具有顯著性。經過水迷宮訓練后，與模型組相比，高劑量和低劑量組大鼠潛伏期時間明顯縮短(P＜0.01)，與假手術組相比，低劑量組具有顯著差異(P＜0.05)，高劑量組潛伏期時間沒有顯著差異。腦脈泰改善慢性腦缺血大鼠的學習記憶能力，給予高劑量時作用更顯著(見表1)。

定位航行試驗5 d 撤除原平臺進行空間探索實驗，與假手術組相比，模型組跨越原平臺所在象限的時間明顯縮短(P＜0.01)，且跨越次數明顯減少(P＜0.01)。與模型組相比，腦脈泰高、低劑量組大鼠跨越原平臺所在象限的時間明顯延長(P＜0.01)，而跨越次數明顯增加(P＜0.01)。腦脈泰可增強慢性腦缺血大鼠的空間記憶能力(見表2)。

2.2 腦脈泰對慢性腦缺血大鼠海馬CA1區神經元的影響 與假手術組相比，模型組大鼠海馬錐體細胞壞死脫落明顯，層次紊亂，細胞結構不清晰，大量細胞出現核固縮和碎裂現象。腦脈泰給藥組大鼠海馬CA1區錐體細胞形態、層次、排列、細胞核染色均較模型組有明顯改善(見圖1)。

2.3 免疫組化結果

2.3.1 腦脈泰對慢性腦缺血大鼠海馬CA1區NGF 表達的影響 免疫組織化學染色顯示，與假手術組相比，模型組大鼠海馬CA1區NGF 表達明顯減少(P＜0.01)，與模型組相比，腦脈泰給藥低劑量和高劑量組都增加NGF 的表達(P＜0.05 和P＜0.01)，與假手術組相比，高劑量組沒有顯著差異(見圖2、表3)。

2.3.2 腦脈泰對慢性腦缺血大鼠GFAP 表達的影響 與假手術組相比，模型組大鼠腦組織GFAP 表達增加(P＜0.01)。與模型組相比，腦脈泰低、高劑量都能減低GFAP 的表達，差異具有統計學意義(P＜0.01)。與假手術組相比，腦脈泰高劑量的作用顯著，差異具有統計學意義(P＜0.05)(見圖3、表3)。

圖1 腦脈泰對慢性腦缺血大鼠海馬CA1區病理形態的影響(HE 染色)

圖2 腦脈泰對慢性腦缺血大鼠海馬CA1區NGF 表達的影響

圖3 腦脈泰對慢性腦缺血大鼠腦組織GFAP 表達變化

表1 腦脈泰對慢性腦缺血大鼠定位航行實驗潛伏期時間的影響(±s，s)

表1 腦脈泰對慢性腦缺血大鼠定位航行實驗潛伏期時間的影響(±s，s)

與假手術組相比* P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組相比△P＜0.05，△△P＜0.01

表2 腦脈泰對慢性腦缺血大鼠空間探索實驗的影響(±s)

表2 腦脈泰對慢性腦缺血大鼠空間探索實驗的影響(±s)

與假手術組相比* P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組相比△P＜0.05，△△P＜0.01

表3 腦脈泰對慢性腦缺血大鼠NGF、GFAP 表達的影響(±s)

表3 腦脈泰對慢性腦缺血大鼠NGF、GFAP 表達的影響(±s)

與假手術組相比* P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組相比△P＜0.05，△△P＜0.01.

3 討論

慢性腦缺血是神經系統一種常見的病理生理狀態，由長期腦灌注不足引起，可出現能量代謝障礙、氧化應激、神經遞質改變、神經元缺失等變化，同時伴有大量膠質細胞增生，是阿爾茲海默病和血管性癡呆等許多與年齡相關性疾病的共同的病理生理過程［5］。慢性腦缺血導致的血管性癡呆以持久性或進展性認知功能障礙為主要特點，表現為學習記憶能力下降。我們前期實驗［6］已證實，2VO 術后大鼠海馬區及額葉皮質腦血流量的下降，大鼠出現進行性認知障礙。由于海馬和額葉皮質特殊的結構特點，成為腦缺血時受損最敏感的區域。海馬與學習和記憶有著密切關系，尤其是CA1區細胞參與信息的加工、強化和傳遞，其受損導致進展性認知功能障礙［7］。所以本實驗中采用2-VO 制備大鼠血管性癡呆模型。水迷宮是Morris 在1984 年發明的，隨后被實驗者用來評價動物的空間學習和記憶能力［8］。前人實驗證明Morris 水迷宮實驗時大鼠學習記憶能力下降的程度與海馬神經元密度減低呈高度相關。本實驗結果顯示在Morris 水迷宮實驗時2-VO 模型組大鼠學習記憶能力與假手術組相比顯著下降，假手術組大鼠在2 d 潛伏期時間較1 d 明顯縮短，后幾天趨于穩定，在軌跡圖上表現為直線式運動軌跡。而模型組一直是迂回式的運動軌跡，潛伏期時間呈現緩慢下降的趨勢，且下降幅度不如假手術組。HE 染色觀察顯示2-VO 模型組大鼠海馬錐體細胞明顯缺失，與前人文獻報道一致。而腦脈泰給藥高、低劑量組大鼠認知功能得到不同程度的恢復，通過HE 染色觀察腦脈泰對于慢性腦缺血后海馬神經元結構破壞具有保護作用，從而保護了學習記憶能力。

NGF 作為最早發現的腦源性神經生長因子，在腦內廣泛分布于海馬、大腦皮質，是神經系統最重要的生物活性分子之一，不僅在生理狀態下對中樞神經系統具有營養作用，而且在腦缺血時對神經再生、突觸重構和損傷修復發揮重要的作用［9，10］。NGF 減少腦缺血時神經細胞損傷的機制可能與抑制神經細胞凋亡［11］、清除氧自由基、穩定細胞內Ca2+水平及拮抗興奮性毒性［12］有關。本實驗中發現在慢性腦缺血后海馬CA1區NGF 的表達減少，腦脈泰給藥后可以逆轉這種減少，并且腦脈泰高劑量組的NGF 的表達幾乎達到正常水平，與假手術組比較沒有顯著差異。腦脈泰可能通過提高海馬CA1區NGF 的表達來發揮保護海馬神經元的作用。由于本實驗未觀察不同時間段NGF 表達的變化，所以腦脈泰給藥后NGF 表達的時間依賴性及神經保護作用機制需要進一步探索。

腦缺血時，神經元細胞凋亡，星形膠質細胞反應性增生，而GFAP 作為星形膠質細胞微絲的結構蛋白，是其標志性蛋白之一，反映了星形膠質細胞的活化狀態。星形膠質細胞的活化情況與神經系統的損傷程度相關，輕度損傷時星形膠質細胞的形態變化可逆轉，但在重度損傷時則不能［13］。星形膠質細胞活化在腦缺血中具有雙重作用:一方面產生神經營養因子，促進損傷神經元的修復;另一方面過度的膠質化可形成物理屏障，干擾髓鞘和軸索的再生［14］，加重腦缺血損傷。活化的星形膠質細胞分泌的一些細胞因子在腦損傷早期起保護作用，后期形成膠質瘢痕后則不能發揮積極作用。本研究發現，慢性腦缺血2-VO 模型組大鼠腦組織的GFAP 表達明顯增加，說明慢性腦缺血存在星形膠質細胞活化。腦脈泰給藥高、低劑量組都能不同程度的降低GFAP 的表達，減少星形膠質細胞的活化，低劑量組的作用與假手術組相比沒有明顯差別，幾乎達到正常水平。腦脈泰對慢性腦缺血大鼠的認知功能具有保護作用，可能通過提高NGF 表達和減少慢性腦缺血時星形膠質細胞的活化來發揮腦保護的作用。

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