丙戊酸誘導大鼠骨髓間充質干細胞向神經樣細胞分化中對Oct-4 的影響

靳久增，劉 宇，白 霜，黃 鑫

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymalstem cells，BMSCs)是一種來源于骨髓的成體干細胞，具有自我更新和多向分化特性，在一定的刺激因子和環境作用下可分化為神經元樣細胞、心肌細胞、成骨細胞、軟骨細胞及脂肪細胞等。但有關干細胞定向誘導分化調控機制的研究尚未取得突破性進展。研究表明組蛋白去乙酰化酶抑制劑能夠抑制腫瘤細胞生長和干細胞分化，本研究應用組蛋白去乙酰化酶抑制劑丙戊酸作為誘導劑，探索大鼠BMSCs分化成神經樣細胞對Oct-4 的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器 主要試劑DMEM/F12、胎牛血清(FBS)均購自hyclone 公司。兔抗NSE 抗體購自Cell Signaling Technology、GFAP 抗體購自BD 公司、Oct-4 抗體購自abcam 公司、免疫組化試劑盒為中杉金橋公司出品;β-ME 為Biotopped公司產品。其余試劑均為國產分析純級試劑。CO2細胞培養箱(Thermo Revco)、超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)、倒置相差顯微鏡(Olympus)、離心機(Eppendorf)。

1.2 動物 為雄性SD 大鼠，體重100 g 左右，普通級，購于鄭州大學實驗動物中心。

1.3 BMSCs 的體外分離培養及鑒定 SD 大鼠頸脫位法處死，放入75%酒精內浸泡5 min。在無菌條件下，取出脛骨和股骨，剪斷骨骺，滅菌的PBS 緩沖液反復沖洗;得到的沖洗培養液吹打后，以1×106/ml 接種到培養瓶，置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養箱中培養3 d 后首次換液，7～8 d 傳代。以后每3～4 d 傳代，第3～4 代后細胞純化后用于實驗。P3 代骨髓間充質干細胞常規消化離心，調整細胞濃度為1×106/ml，100 μl 每管分裝于EP 管中，分別加入CD45-FITC、CD90-FITC 單抗5 μl，室溫避光孵育30 min 后流式細胞儀檢測結果。

1.4 體外誘導BMSCs 向神經細胞分化及丙戊酸的干預 將細胞分為兩組，對照組:不加丙戊酸，當第3 代細胞達80%～90%融合時開始進行誘導分化，加入預誘導液DMEM/F12 培養基/體積分數為10%的FBS/1 mmol/L β-巰基乙醇(β-ME)培養24 h，而后換為誘導液DMEM/F12 培養基/體積分數為2%二甲基亞砜(DMSO)/200 μmol/L 丁羥茴醚(BHA)誘導5 h。誘導過程中在倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化。實驗組:誘導分化前12 h，在細胞培養基中加入丙戊酸(濃度200 μg/ml)，其它同對照組。

1.5 免疫熒光細胞化學染色 誘導后的細胞用PBS 洗滌2 次后，用4%多聚甲醛固定30 min，PBS 再洗滌后，加入3% H2O2封閉10 min，5% BSA封閉20 min，分別加入神經特異性烯醇化酶(NSE)抗體(1∶100)、大鼠膠質纖維酸性蛋白(GFAP)抗體(1:100)、單克隆抗體室溫孵育2 h 后，置4℃過夜，PBS 洗滌，分別滴加1∶200 稀釋的生物素山羊抗兔和山羊抗小鼠二抗，置濕盒45 min，ABC 復合物，37 ℃濕盒孵育1 h，PBS 洗滌，DAB 溶液顯色，脫水透明，中性樹膠封片，光鏡觀察。

1.6 Western blot 檢測NSE、GFAP、Oct-4 蛋白表達水平:誘導后的細胞，按細胞總蛋白提取試劑盒提取各組細胞總蛋白，制備SDS-PAGE 凝膠后上樣30 μg，70～120 V 恒壓電泳，250 mA 恒流轉膜70 min，5%～20%脫脂牛奶封閉2～4 h，4 ℃孵育一抗NSE 抗體(1∶100)、GFAP 抗 體(1∶1 000)，洗膜，孵育二抗(1∶4 000)，顯影、定影，以β-actin為內參照，實驗重復3 次。

1.7 統計學方法 用SPSS 17.0 軟件進行數據分析。兩組數據采用卡方檢驗P≤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞形態觀察及鑒定 剛接種的骨髓間充質干細胞(BMSCs)為大小均一的圓形細胞，24 h后細胞開始貼壁生長，8～12 d 后細胞長成典型的長梭形，傳代后的BMSCs 生長迅速，3～4 d 傳代一次，呈集落生長，仍貼壁，形態多樣(見圖1)。誘導后的細胞為伸出突起的神經樣細胞形態，有軸突和樹突出現(見圖2)。丙戊酸誘導12 h 后的細胞已經部分細胞開始分化生神經樣細胞(見圖2 A1、A2)。丙戊酸預處理后的實驗組神經樣細胞的突出明顯多于對照組細胞。表面骨髓基質標志CD90 高達95.62%，造血細胞標志CD45 表達為0.36%(見圖3)。

圖1 細胞形態觀察

圖2 細胞形態觀察

圖3 第3 代BMSCs 的表面標志物

2.2 免疫細胞化學鑒定 誘導后實驗組和對照組的細胞均有NSE、GFAP 染色陽性的細胞，即誘導后的細胞為神經細胞(見圖4)

2.3 Western blot 實驗組的誘導后神經細胞蛋白的表達明顯高于對照組細胞表達水平，Oct-4 的表達實驗組高于對照組(見圖5～圖7、表1)。

圖4 免疫細胞化學

圖5 NSE 蛋白的表達

圖6 GFAP 蛋白的表達

圖7 Oct-4 的表達

表1 兩組NSE、GFAP、Oct-4 蛋白相對表達水平(n=3)

3 討論

骨髓間充質干細胞是一種從骨髓中分離得到的一類中胚層來源的未分化干細胞，具有自我增殖和多向分化潛能，已有大量的體內外研究證明骨髓間充質干細胞在一定條件下可誘導分化為神經細胞。［1，2］有研究表明β-ME、DMSO 和BHA、PDGF 等作為誘導劑，成功的在體外定向誘導骨髓間充質干細胞分化為神經元樣細胞。同時它表達神經元特異性烯醇化酶(NSE)、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)［3］和神經微絲M(NF-M)［4］等神經細胞標志物。

丙戊酸(VPA)是一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑，其作為一種抗癲癇、抗驚厥和情緒穩定藥物被廣泛應用于臨床。研究表明，組蛋白去乙酰化酶(HDAC)在分化中發揮著重要作用。組蛋白與DNA具有高度親和力，由于丙戊酸和組蛋白結合緊密，阻礙了基本轉錄單位蛋白復合體進入啟動子結合位點，導致轉錄抑制。作為HDAC 的抑制劑，能使HDAC 的作用受到抑制，使組蛋白和DNA 的親和力下降，使染色體的結構松散，有利于細胞分裂、增殖。［5］本實驗證明丙戊酸能夠誘導骨髓間充質干細胞向神經樣細胞轉化，并且提高其誘導的效率，使得神經樣細胞的軸突和樹突比對照組更多，細胞在一定時間誘導成神經樣細胞比例更多。并且丙戊酸在預處理12 h 時，骨髓間充質干細胞就有一部分開始分化長出突出，分化成神經樣細胞了(見圖2 A1、A2)。可以得出由丙戊酸預處理后，又經經典的誘導方法誘導的細胞，其誘導后的神經樣細胞比只有經典方法誘導的細胞更有明顯的神經元結構。

研究證明，Oct-4 是屬于POU 家族的轉錄因子，它由Pou5f1 基因編碼產生，是多能性干細胞或全能干細胞的標志物，在維持細胞的干細胞特性上起非常重要作用。有研究表明Oct-4 在胚胎干細胞分化中表達會下降。即骨髓間充質干細胞誘導成神經樣細胞的前后Oct-4 的表達會下降［6，7］。Oct-4 表達的水平同樣決定著鼠胚胎干細胞的命運走向:適當水平的表達可維持胚胎干細胞的未分化［8，9］;上調約2倍水平會誘導胚胎干細胞分化為內胚層、中胚層;表達正常水平的50%則可以觸發向外胚層的分化。本實驗結果同時顯示，第3 代的BMSCs 誘導后分化成神經樣細胞，而第3 代被丙戊酸預處理后的細胞比第3 代的BMSCs 未經丙戊酸預處理的細胞的Oct-4表達增多，即丙戊酸增強了Oct-4 在BMSCs 體外定向誘導分化中的表達。由此可見，Oct-4 基因可能與成體干細胞多潛能性的維持有關。

綜上，本研究成功建立了大鼠骨髓間充質干細胞和大鼠神經樣細胞培養體系，實驗觀察到，在體外分離出骨髓間充質干細胞和骨髓間充質干細胞誘導后具有神經樣細胞的特點，同時觀察到丙戊酸能夠成功誘導骨髓間充質干細胞向神經樣細胞的分化，并且提高其誘導分化的程度［10］。在大鼠BMSCs 定向誘導分化中，Oct-4 在實驗組比較對照組表達增多，提示Oct-4 基因可能也參與了成體干細胞多潛能性的維持。本研究為進一步研究骨髓間充質干細胞誘導方法及Oct-4 在小鼠BMSCs 增殖分化中的作用、探討BMSCs 的誘導分化調控機制提供了理論和實驗資料。

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