淫羊藿苷對腦缺血大鼠PTEN 和GAP-43 蛋白表達的影響

徐成成，張鵬飛，丁新生，李文磊，吳明華

缺血性腦血管病占腦血管病的80%～85%［1～3］，是導致人類死亡和殘疾的主要原因，在中國已經位居第一位［2］。腦缺血后能激發神經干細胞的增殖反應和軸突再生、突觸再聯系的研究報道，為腦缺血后的再生修復帶來了希望［4，5］，尋找促進神經再生修復的有效途徑是目前研究的熱點。

淫羊藿是傳統中醫藥里經常用的一種補益肝腎藥物，最近的研究發現，其主要成分淫羊藿苷能夠上調神經生長因子的表達，促進神經干細胞的增殖和神經元分化，改善癡呆大鼠記憶功能［6～8］。因此淫羊藿苷在神經再生修復領域具有廣闊的研究前景，但是其是否能促進腦缺血后神經功能恢復及通過何種機制尚未得到有效闡述。PTEN(phosphatase and tensinhomology deleted on chromosome ten)作為一種腫瘤抑制基因，近年來發現其在神經的發生和神經再生過程中起著重要作用，是神經系統發育成熟過程中軸突生長和再生能力逐漸下降的一個非常重要的內在控制分子，抑制PTEN 能明顯促進成熟神經系統再生修復［9］。GAP-43(Growth associated protein-43)是一種胞膜磷酸蛋白質，是一種神經特異性的蛋白質，廣泛存在于神經組織中，在生長、分化和再生的軸突末端以及突觸前膜含量極高，主要參與神經細胞外生長及突觸發育形成和神經細胞再生［10，11］。

本實驗旨在通過觀察淫羊藿苷對胡須體覺皮質局灶性腦缺血大鼠功能的恢復以及腦梗死周邊區組織PTEN 和GAP-43 蛋白的表達情況，以探究淫羊藿苷對腦缺血后神經再生修復的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年雄性SD 大鼠24 只，體重300±10 g，年齡2.5～3 m。由江蘇省中醫院藥理實驗室提供。

1.2 主要試劑及儀器 10%水合氯醛;2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC);磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4);SDS、Tween-20、過硫酸胺、TEMED，丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，PMSF，甘氨酸，Tris(Sigma，St Louis，MO，USA);PVDF 膜(BioRad，Hercules，CA，USA);最適切割溫度復合物(OCT，Sakura Finetek USA Inc，Torrance，CA，USA);生理鹽水(0.9%NaCl);兔源抗PTEN(CST，USA);兔源抗P-S6R(CST);鼠源抗GAP43(CST，USA);鼠源抗Actin(santa cruz);辣根過氧化物酶標記的羊抗兔、羊抗鼠二抗(santa cruz，USA)。解剖顯微鏡;垂直電泳儀、轉膜儀;凝膠成像系統;恒冷振動切片機(Ultapro 5000，St Louis，MO，USA);熒光顯微鏡(尼康)。

1.3 動物模型制備及分組 參照文獻［12］建立胡須體覺皮質局灶性腦梗死模型。大鼠經10%水合氯醛400 mg/kg 腹腔注射麻醉后，將動物左側臥位固定于手術臺上。顯微鏡下靠近眶后切開右顳側皮膚及顳肌，鈍性分離肌肉組織，暴露右側顳骨;手術電鉆在前囟水平距中線右側4.1 mm 處(ML+4.1 mm)開一3～4 mm 的顱骨窗，保持硬腦膜完整。11.0 手術線穿過硬腦膜，結扎胡須體覺皮質周圍2～3 支大腦中動脈的分支，同時結扎雙側頸總動脈10 min，之后用可吸收縫合線縫合皮膚。3 d 后將造模大鼠隨機分為8 只淫羊藿苷治療組與8 只模型組，8 只假手術組大鼠做同樣處理，但不結扎大腦中動脈。治療組給予淫羊藿苷灌胃，淫羊藿苷用生理鹽水按10 mg/ml 配制，每天灌胃1 次，每次每只大鼠按10 ml/kg 比例給藥。模型組和假手術組每天給予等量的生理鹽水灌胃。

1.4 行為學測定 通過Corner Test 方法［13］，分別于造模前3 d，造模后3 d、給藥后7 d、14 d 和21 d 進行行為學檢測。具體方法為將大鼠放入一個一端封閉的由兩塊30 cm×20 cm×1 cm 的平板構成的30°的夾角，將一塊底16 cm，腰30 cm 的等腰三角形的平板覆蓋于夾角之上，并且在夾角的上半部有15 cm×1 cm 的縫隙(見圖1A)。當大鼠進入夾角(corner)深部，雙側的觸須將受到刺激，繼而大鼠將“站立轉身”或“貼地轉身”(頭部從腹部下方鉆過的屈曲轉身)面向夾角的開口端。每只大鼠每次做10 次，計算左轉、右轉次數，常大鼠在進行檢測時，向左向右轉身的次數基本相等，右側腦缺血大鼠向右側(病灶側)轉身的次數會明顯增加。

1.5 Western blotting 檢測 腦缺血后21 d，斷頭處死大鼠并取出梗死區周邊腦組織，運用Western blot 法檢測其PTEN 和GAP-43 蛋白的表達情況。首先提取組織蛋白，應用eppendorf 分光光度計測出樣品中濃度，用0.01 mol/L PBS(pH=7.4)稀釋所有樣品到4 μg/μl。樣本進行SDS-PAGE 凝膠電泳，轉PVDF，放入封閉緩沖液中，室溫封閉1H，后分別進行一抗及二抗的孵育:一抗在-4℃冰箱中搖床過夜，取出后用TBST 搖床清洗6 次，每次10 min，之后進行二抗孵育，二抗在37℃孵育箱內孵育2 h。按試劑盒要求配制化學發光試劑，滴加在膜上，經凝膠成像系統掃描并分析目的蛋白的表達。

1.6 統計學方法 所以數據經過方差齊性檢驗和正態性檢驗，實驗數據用±s 表示，采用SPSS 19.0 統計軟件進行分析，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。相關圖形采用Graphpad Prism 5 軟件進行繪圖。

2 結果

2.1 淫羊藿苷促進腦缺血后功能恢復 假手術組和造模組大鼠在手術前1 d 向左、向右“貼地轉身”的幾率接近，均在50%左右。手術后3 d 淫羊藿苷組與模型組向右側(損傷同側)轉身的次數較假手術組明顯增多(P＜0.05)，給藥7 d 后(術后10 d)淫羊藿苷組大鼠右轉次數開始減少(共10 次夾角實驗及其右轉次數，下同)，而模型組大鼠右轉次數幾乎沒有變化，但二者比較差異無統計學意義(P＞0.05);給藥后14 d(術后17 d)淫羊藿苷組大鼠右轉次數繼續減少，模型組大鼠右轉次數稍有所減少，二者比較差異有統計學意義(P＜0.05);給藥21 d 后(術后24 d)淫羊藿苷組大鼠右轉次數較模型組大鼠右轉次數明顯減少(P＜0.05)，與假手術組大鼠基本接近(P＞0.05);假手術組大鼠不論何時向左、向右轉的幾率均接近(見圖1)。

圖1 Corner Test 檢測結果

2.2 淫羊藿苷抑制腦缺血后PTEN 蛋白表達

增加GAP-43 蛋白表達 給藥21 d 后各組大鼠腦組織PTEN 與GAP-43 蛋白的表達見圖2。模型組大鼠GAP-43 蛋白表達較假手術組升高，差異有統計學意義(P＜0.05)，而淫羊藿苷組大鼠GAP-43 蛋白表達較模型組及假手術組大鼠均明顯增高(P＜0.05);模型組PTEN 蛋白的表達較假手術組下降，差異有統計學意義(P＜0.05)，而淫羊藿苷組PTEN蛋白表達較模型組及假手術組大鼠均明顯降低(P＜0.05)。

圖2 給藥后21 d Western blot 檢測結果

3 討論

目前，對于腦梗死的治療仍沒有有效的治療手段［14］。溶栓血管再通治療是急性腦梗死最有效和循證醫學支持的治療方法，但由于時間窗的限制，只有極少一部分患者能夠采取這項治療手段［15］。大部分腦梗死患者是不能溶栓而遺留不同程度的神經功能缺失，對于這些患者，唯一長期有效的治療方法就是促進神經組織再生修復。

淫羊藿為小檗科(Berberidaceae)淫羊藿屬(Epimedium)植物，其作為藥物運用具有很長的歷史，始載于《神內本草經》，別名仙靈脾。李時珍在《本草綱目》中記載其功效有“益精氣，堅筋骨，實腰膝，強心力”。淫羊藿主要藥用成分是黃酮類化合物和多糖，淫羊藿總黃酮(total flavonoids of Epimedium，TFE)主要含有淫羊藿苷(Icariine，ICA)和淫羊藿次苷等。吳芹等［6］證實淫羊藿苷可以上調海馬組織中BDNF 和TrKBmRNA 的表達。YAO 等［8］研究發現淫羊藿總黃酮(EF)可有效的的促進神經干細胞的增殖和神經元分化。Wu 等［7］通過給老年癡呆模型的老鼠給予淫羊藿苷治療后神經再生和神經干細胞活化能力得到改善，其認知能力也得到很大改善。但是其是否能促進腦缺血后神經功能恢復及通過何種機制尚未得到有效闡述。

通過神經再生機制促進肢體功能恢復方面的研究已經有很多，但目前最具說服力還是抑制PTEN這條途徑。2010 年，何志剛團隊應用類似的方法成功的證明抑制PTEN 活性能夠顯著促進脊髓損傷后損傷部位的軸突再生和神經功能的恢復［16］。其進一步的研究表明，PTEN 是mTOR 通路的負性調節子，二者的表達在中樞神經系統(CNS)發育過程中呈現動態變化。隨著發育的逐漸成熟，PTEN 表達逐漸升高，mTOR 表達逐漸下降，致使神經元軸突的生長能力逐漸下降。軸突損傷后進一步上調PTEN表達，抑制mTOR 活性，阻礙軸突再生。因此，抑制PTEN 后，重新激活mTOR 通路，使成年神經系統回到胚胎時期的生長狀態，恢復胚胎時期的再生能力，從而促使CNS 損傷后再生［17］。類似的，Christie 等也在坐骨神經損傷模型中發現抑制PTEN 能促進周圍神經軸突的再生能力［18］。由此可見，PTEN 是神經系統發育成熟過程中軸突生長和再生能力逐漸下降的一個非常重要的內在控制分子，PTEN 在成年神經系統內高表達是軸突損傷后再生困難的主要原因之一，抑制PTEN 可有效地促進損傷神經軸突的再生、突觸聯系的建立和神經功能的恢復。神經元生長相關蛋白43(GAP-43)與軸突生長、突觸細胞膜再生和突觸的功能有著密切的關系［19］，其分布于神經元、再生的施旺細胞和神經膠質細胞，是神經元生長發育、神經再生以及成熟中樞神經系統中突觸重建和可塑性的分子標志物［20］。

在本研究中，我們應用胡須體覺皮質局灶性腦缺血大鼠模型，觀察淫羊藿苷對腦缺血后功能恢復的情況及可能的機制。Corner text 行為學結果顯示，淫羊藿苷能明顯減少腦缺血后大鼠右轉次數，表明淫羊藿苷明顯促進腦缺血后胡須功能的恢復;Western blot 實驗結果淫羊藿苷明顯抑制梗死灶周邊區PTEN 蛋白的表達，同時促進GAP-43 蛋白表達。我們的研究結果提示，淫羊藿苷促進腦缺血后的神經功能恢復，可能是通過抑制PTEN 后促進神經突觸再生、GAP-43 表達上調實現的。進一步的研究需要通過藥物或基因的手段抑制和上調PTEN 的表達，來進一步驗證二者之間的因果關系。我們還觀察到，與假手術組相比，模型組沒有得到治療也出現PTEN 表達下降GAP-43 表達上調，而且具有統計學意義，但夾角實驗右轉次數出現下降但不明顯，這可能和卒中促進機體內源性神經細胞和突觸再生有關，但再生的程度還沒有達到使神經功能明顯改善的程度。

總之我們通過本實驗初步證實了，淫羊藿苷可以通過抑制PTEN 促進神經再生，恢復神經功能。為腦缺血后神經再生修復提供了新的途徑，為中醫藥在神經再生領域的臨床應用提供了理論基礎和實驗依據。

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