高效液相色譜檢測甲氨喋呤方法的改進

鄭惠良 楊瑩 鄭斐洋 施佳辰 楊萍

高效液相色譜檢測甲氨喋呤方法的改進

鄭惠良 楊瑩 鄭斐洋 施佳辰 楊萍

目的探討高效液相色譜檢測甲氨喋呤方法的改進。方法對血漿樣品進行處理, 色譜分離所用色譜柱為Chromegabond BASC18, 柱溫35℃, 流動相：0.15 mol/L, 流速1.5 ml/min。結果在血藥濃度為0.2～50 mg/L時, 甲氨喋呤具有良好的線性關系, 其最低檢測濃度為5 ug/L。結論高效液相色譜檢測甲氨喋呤的方法具有簡便、快捷、精確的特點, 適用于甲氨喋呤的血藥濃度監測。

高效液相色譜；甲氨喋呤；方法改進

甲氨喋呤(MTX)屬于抗代謝類藥物[1], 多用于抗腫瘤治療, 臨床常聯合MTX和四氫葉酸鈣(CF)治療急性白血病、骨肉瘤和淋巴瘤等, 以減少藥物對腎臟、骨髓和其他器官的毒性作用, 提高MTX應用的可行性和安全性。為了對MTX血藥濃度進行監測, 快速準備對樣品處理十分重要,通常所用蛋白質沉淀劑為高氯酸, 本次研究所選沉淀劑為硝酸銀, 分析了高效液相色譜檢測甲氨喋呤方法的改進, 現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源 本次研究所需儀器包括：高效液相色譜儀、柱控溫箱、紫外檢測器、漩渦混懸器、水平離心機、抽濾器、超純水機、超聲清洗器、數據處理機。所需試劑：色譜純為乙腈、甲醇, 分析純為乙酸鈉、高氯酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉, 水為重蒸水, 甲氨喋呤(MTX)對照品由中國生物制品檢定所供給。

1.2 方法

1.2.1 內標溶液與標準品配制 稱取適量MTX, 置入100 ml量瓶, 與稀氫氧化鈉混合溶解, 制成1.1 mg/ml儲備液, 保存于4℃冰箱中, 使用時先稀釋至需要濃度。內標溶液：取對照品甲硝唑, 置入100 ml量瓶, 用甲醇溶解并稀釋, 保存于4℃冰箱中。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：150 mm×4.6 mm的Chromegabond BASC18[2], 流動相：0.15 mol/L, 乙腈與乙酸鈉的體積比為11∶89, 柱溫35℃, 流速1.5 ml/min, 進樣量10 μl, 檢測波長303 nm, 流動相使用超聲脫氣和前經超濾。

1.2.3 樣品處理 取0.5 ml血清, 置入離心管, 添加1 ml濃度為6%的高氯酸溶液, 漩渦振蕩1 min后, 離心10 min, 速度為3500 r/min, , 取0.45 μm上清液, 經濾膜過濾后得到30 μl進樣, 定量分析10 μl。

1.2.4 標準曲線 取5 ml MTX儲備液, 置入25 ml量瓶, 利用空白血漿將其稀釋至所需刻度, 得到濃度為100 mg/L的標準樣品。將血漿樣品分別用空白血漿稀釋成濃度為0.2、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 mg/L的對照品血漿樣品, 經HPLC分析,縱坐標為MTX濃度, 橫坐標為MTX峰面積和內標物峰面積比值, 利用回歸方程：Y=2.83X-0.4, r=0.9997(n=7), 得出MTX在0.2～50 mg/L范圍內的線性關系良好, MTX的最低檢測濃度為5 μg/L。

1.2.5 回收率提取試驗 在空白血漿中加入適量MTX儲備液, 將MTX分為0.2、5.0、50.0 mg/L 3個濃度的樣品, 處理后進樣后, 取適量MTX對照品儲備液, 以流動相將其配制為濃度相當的MTX溶液, 直接進樣, 并將其作為表現, 比較兩組的峰面積, 計算在血漿中MTX的提取回收率。

2 結果

2.1 精密度測定結果 在空白血漿中加入適量MTX儲備液,將MTX分為0.2、5.0、50 mg/L3個濃度的樣品各5份, 當天和連續5 d對5個樣品進行測定, 計算當天和5 d中的精密度。見表1。

表1 MTX回收率和精密度(±s, %)

表1 MTX回收率和精密度(±s, %)

質量濃度(mg/L) 提取回收率(%) 方法回收率(%) 當天精密度 5 d間精密度0.29 6.6±3.5 98.3±4.4 4.14 5.22 5.0 98.6±3.1 101.4±2.9 3.21 4.16 50 97.8±3.7 99.6±3.5 3.64 4.37

2.2 穩定性測定結果 向空白血漿中加入適量MTX儲備液,室溫留樣, 在0、2、4、8、16、24 h分別進行處理進樣, 得到MTX面積RSD為3.7%, 表明血漿樣品具有穩定性。

3 討論

利用建立的方法監測MTX治療的血藥濃度。患者A, 男,原患疾病為乳腺癌, 年齡42歲, 6 h靜脈滴注MTX 2.4 g；患者B,男, 原患疾病為急性白血病, 年齡6歲, 16 h靜脈滴注2.4 g；患者C, 女, 原患疾病為淋巴癌, 年齡52歲, 20 h靜脈滴注4.0 g；患者D, 女, 原患疾病為骨肉瘤, 年齡41歲, 8 h靜脈滴注9.5 g；患者E, 男, 原患疾病為骨肉瘤, 年齡54歲, 8 h靜脈滴注9.0 g。從靜脈滴注結束時開始采樣, 采集到血漿樣品后立即測定, 對測定結果MTX超過50 mg/L的血漿樣品進行稀釋, 再次測定；取50 μl測定結果低于0.2 mg/L 的血漿樣品。

目前, 多數研究認為MTX所致中毒的血藥濃度為停藥后24 h, 濃度超過4.54 mg/L；停藥后48 h, 濃度超過0.454 mg/L；停藥后72 h, 濃度超過0.045 mg/L。若停藥后24 h其血藥濃度不足2.27 mg/L, 停藥48 h濃度不足0.227 mg/L, 停藥72 h濃度不足0.045 mg/L, 則所致不良反應較少。在臨床應用中,通常根據MTX的測定結果對首次應用CF時機進行指導, 總劑量是MTX總量的5%[3], 解救次數和解救停止時間取決于停藥48 h和72 h的血藥濃度[4]。患者D停藥48 h的血藥濃度為達到安全值, 適當增加了解救時間, 停藥72 h的血藥濃度降至0.045 mg/L以下, 達到了安全濃度值, 表明可以停止解救。其余患者化療后均無嚴重不良反應發生。

本次研究結果表明, 利用硝酸銀作為蛋白質沉淀劑對血漿樣品進行處理, 檢測方法線性范圍廣、靈敏度高、回收率高,適用于臨床對MTX藥動學和血藥濃度的分析研究[5]。

[1]向芳. RP-HPLC法測定大劑量化療時人血漿中甲氨喋呤濃度.國際醫藥衛生導報, 2008, 14(10):76-79.

[2]崔練.改良反相高效液相色譜法監測血清中甲氨喋呤濃度及臨床應用.檢驗醫學, 2006, 21(5):445.

[3]黎遠冬.高效液相色譜法測定人體血漿中甲氨蝶呤濃度方法的改進.中國醫院藥學雜志, 2007, 27(8):1090.

[4]王璐璐. HPLC研究甲氨喋呤磁靶向脂質體在小鼠體內的組織分布.中國藥學雜志, 2006, 41(20):1572.

[5]李海菊. HPLC監測甲氨喋呤血藥濃度方法的改進與優化.中國藥物應用與監測, 2004, 3(1):51.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.18.214

2015-01-22]

450000 鄭州大學醫學實驗中心(鄭惠良 楊瑩)；加州大學歐文分校(鄭斐洋)；鄭州大學臨床醫學系(施佳辰)；鄭州大學第一附屬醫院生殖中心(楊萍)