慢性阻塞性肺疾病大鼠肺表面活性蛋白A表達的變化

索丹

慢性阻塞性肺疾病大鼠肺表面活性蛋白A表達的變化

索丹

目的以煙熏慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠的肺組織為標本, 檢測肺表面活性蛋白A(SPS-A)在COPD病程中的變化。方法選取健康雄性七周齡Wistar大鼠25只, 體重180～220 g, 隨機分為對照組(5只)與COPD組(20只)。采用煙熏法制備COPD大鼠模型, 按照COPD病程的時間分為4組, 每組5只, 分別為COPD 1 d組(A組)、COPD 1月組(B組)、COPD 2月組(C組)、COPD 3月組(D組)。采用免疫組織化學法, 檢測表面活性蛋白A在各組大鼠肺組織中的表達。結果該法建立COPD大鼠模型的肺組織病理學改變基本符合人類COPD組織病理學改變特點。免疫組化顯示COPD組的A、B、C、D組 SP-A檢測結果(OD值), 與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01), COPD組中D組SP-A檢測結果(OD值)較A、B、C組有所回升, 差異有統計學意義(P＜0.05)。結論SP-A在煙熏COPD大鼠肺組織中的表達比正常對照組明顯減少, 與肺氣腫的嚴重程度成負相關。COPD大鼠肺組織中SP-A明顯減少可能是COPD發生發展的重要因素之一。

慢性阻塞性肺疾病；肺表面活性蛋白A；煙熏

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是世界上發病率和死亡率的重要原因之一。肺表面活性物質(PS)是一種脂質與特異蛋白結合而成的脂蛋白復合物 , 主要由肺泡II型上皮細胞合成,能降低肺泡的液-氣界面表面張力 , 以防止肺泡在低肺容量時塌陷 , 對維持肺的正常功能至關重要。SP-A主要在肺泡Ⅱ型上皮細胞中表達[1], 是肺表面活性物質的重要成分之一, 本實驗觀察了煙熏所致肺氣腫模型肺組織中SP-A表達變化 , 并與肺組織病理學改變進行對比研究 , 以探討其在COPD中的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性7周齡Wistar大鼠25只, 體重180～220 g(由中國醫科大學附屬盛京醫院實驗動物中心提供)。

1.1.2 實驗試劑 兔抗SP-A購自武漢博士德公司, 免疫組化SABC試劑盒和DAB顯色試劑盒均為武漢博士德公司產品, Poly-Lysine防脫片劑購自武漢博士德公司

1.1.3 實驗儀器及設備 冰箱；圖像分析軟件： NIS-Elements BR2.0型 日本尼康公司；顯微鏡：ECLIPSE E800型日本尼康公司；冰凍切片機 LEICA CM 1900 德國。

1.2 實驗方法

1.2.1 采用煙熏法制備COPD大鼠模型。根據文獻介紹[2]：煙熏70 d大鼠可以形成COPD模型, 因此以煙熏70 d為準,進行取材。25只大鼠隨機分為對照組(5只)與COPD組(20只), 按照COPD病程的時間分為4組, 每組5只, , 分別為COPD1 d組(A組)；COPD1月組(B組)；COPD2月組(C組)；COPD 3月組(D組)。分別在形成COPD后1 d、1、2、3個月取材。

1.2.2 標本制備 氯胺酮(100 mg/kg)腹腔內注射麻醉大鼠。顯露氣管, 開胸。取右肺全肺, 于10%甲醛固定, 常規脫水、石蠟包埋, 4 um厚度連續切片3張, 用于免疫組化檢測。

1.2.3 免疫組化法測定SP-A的表達 免疫組化染色法參照試劑盒說明書進行, 載玻片選擇Poly-Lysine防脫片劑處理。SP-A以胞漿棕黃色為陽性。采用NIS-Elements BR2.0型圖象分析儀測定SP-A陽性細胞的光密度( OD值)。

1.3 統計學方法 應用SPSS11.5統計學軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示, 采用t檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

對照組與COPD組肺泡Ⅱ 型上皮細胞 , 細支氣管上皮均可見SP-A表達。對照組未檢到陽性表達；COPD組中 A、B、C組OD值較對照組明顯減少(P＜0.01)；D組OD值增加, 分別由(0.1505±0.0005)降至(0.1385±0.0108)、(0.1311±0.0011)、(0.1257±0.0490)、(0.1431±0.0005)。COPD組OD值明顯低于對照組, 差異有統計學意義(P＜0.01)。見表1。

表1 大鼠肺臟SPA檢測結果(±s)

表1 大鼠肺臟SPA檢測結果(±s)

注：與對照組比較,aP＜0.01； 與A、B、C組比較,bP＜0.05

組別 動物數(只) OD 值對照組 5 0.1505±0.0005 COPD組A組 5 0.1385±0.0108aB組 5 0.1311±0.0011aC組 5 0.1257±0.0490aD組 5 0.1431±0.0005ab

3 討論

COPD是一種具有氣流受限特征的可以預防和治療的疾病, 氣流受限不完全可逆, 呈進行性發展, 與肺部對香煙、煙霧等有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應有關。PS是由脂質和蛋白質組成的復合物, 其中90%是磷脂, 以二棕櫚酰卵磷脂和磷脂酰甘油為主, 后兩者是降低肺泡表面張力的主要活性成分。8%～10%是與脂質特異性結合的蛋白質, 稱之為肺表面活性物質相關蛋白(SPs)。SPs是70 年代末才被認識的一類蛋白質, 目前已發現的SPs 包括親水性的SP-A、SP-D 和疏水性的SP-B、SP-C。其中, SP-A 和SP-D 都是糖結合蛋白, 屬于膠凝素家族成員, 主要由Ⅱ型肺泡上皮細胞和Clara 細胞合成和分泌。SP-A 和SP-D是先天免疫系統的成員[3]。SP-A 是最先被發現且在肺泡Ⅱ型上皮細胞中表達最強烈、信號最豐富的蛋白。SP-A可以幫助形成具有高度表面活性的管狀髓鞘結構, 調節表面活性物質磷脂的循環和分泌, 協助表面活性物質磷脂降低肺泡表面張力, 增強肺泡巨噬細胞的吞噬和殺傷能力。

本實驗發現SP-A在煙熏COPD大鼠肺組織中的表達比正常對照組明顯減少, 且COPD形成后1 d～2個月SP-A的表達逐漸減少。肺氣腫3個月后SP-A的表達有所增加, 提示隨著肺泡重建, Ⅱ型肺泡上皮細胞的合成增多, 其功能亦有恢復, 合成SP-A增多。

綜上所述, SP-A的減少可以促進COPD的發生發展。對于SP-A的檢測提示COPD大鼠肺組織中SP-A明顯減少可能是肺氣腫發展的重要因素之一。本實驗發現應用于臨床,作為COPD的診斷及病情觀察, 以及外源性SP-A應用于臨床治療COPD有待進一步研究。

[1]葉燕青, 李清泉, 程真順, 等. 不同因素致急性肺損傷大鼠的病理轉歸及肺泡表面活性蛋白-A的動態變化. 中華結核和呼吸雜志, 2009, 32(12):950-952.

[2]Spragg RG, Smith RM. Pathology of the surfactant system of the mature lung. Am J Respir Crit Care Med, 1997, 155(2):756-760.

[3]常紹鴻. 支氣管哮喘患者血清SP-A和IL-5測定及其相關性研究. 醫學信息, 2012, 25(6):163.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.18.213

2015-04-13]

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