靶向磁性納米粒子用于急性顳葉癲癇的MRI 研究

付婷婷，孔慶霞，盛華強，高凌云

癲癇是最常見的神經系統疾病之一，約30%為難治性癲癇，其中大多數為顳葉癲癇。手術成為治療難治性癲癇的首選，其關鍵在于致癇灶的定位。美國癲癇協會和神經疾病及中風國家研究所認為AMT 是公認的癲癇替代標記物［1］，其在癲癇灶中具有高攝取的特點。Kaqawa 等［2］采用PET 技術發現在結節性硬化患兒致癇灶內，切除高AMT 代謝區后，可達到癲癇發作停止效果。本研究利用AMT 這一特性和超順磁性納米粒子的各種優勢，將AMT 錨定到MNP 上形成靶向納米探針，嘗試對急性顳葉癲癇模型病灶的定位研究。

1 材料和方法

1.1 磁性納米粒子 結構上我們遵循類似于Akhtari M［3］描述的制作納米粒子的過程，使用核心為γ-Fe2O3 納米晶體，外表為葡聚糖包被。使其平均直徑約20 nm，并將濃度標定至2.4 mg Fe/ml。靶向納米探針是在以上相同尺寸和表面的MNP 的基礎上，通過磁性分離凈化、洗滌、再分散而得，然后將AMT 與功能性的MNP 共價連接。螯合AMT 的MNP 由德國Micromod 公司提供。其濃度標定至2.4 mg Fe/ml，氨基酸密度5 nmol/mg Fe。

1.2 癲癇模型的建立及分組 實驗動物健康雄性Sprague Dawley 大鼠50 只，體重200～250 g，由山東魯抗實驗動物中心提供(生產許可證scxk 魯20130001)。將大鼠腹腔注射氯化鋰(LiCl)127 mg/kg，18～20 h 后給予溴化甲基阿托品1 mg/kg腹腔注射，30 min 后腹腔注射匹羅卡品(Pilocarpine)30 mg/kg，給藥后根據Racine 分級密切觀察大鼠行為學改變評估癲癇發作程度。若注射匹羅卡品后30 min仍未出現IV～V 級癇性發作，則可補充少量的匹羅卡品，一般間隔10～15 min，每次劑量為10 mg/kg，最大追加劑量不得超過60 mg/kg。持續癇性發作(Racine 5 級以上)為成功模型，1 h 后，給予地西泮10 mg/kg 腹腔注射。如不能緩解癇性發作，可給予10%水合氯醛(0.3～0.4 ml/100 g)，直到癇性發作被解除，之后可給予腹腔注射葡萄糖給予能量支持。

造模成功且存活的45 只大鼠按照隨機原則分為Saline 對照組(n=15)、P-MNP 對照組(n=15)、AMT-MNP 組(n=15)。對死亡的癲癇模型大鼠按隨機抽樣原則作及時補充。

Racine 行為學分級標準:0 級:精神狀態良好、行為正常，無抽搐動作;Ⅰ級:頭面部短暫、不自主抽動，如眨眼、須動、咀嚼等，伴有目光呆滯、眼球充血;Ⅱ級:全身不自主顫動、節律性點頭，可伴有前肢抓撓動作;Ⅲ級:一側前肢短暫性、局限性肌陣攣;Ⅳ級:雙側前肢陣攣、抬起，后肢直立;Ⅴ級:全面性強直-陣攣發作，因全身肌肉強直而站立，并失去體位控制、跌倒。

1.3 磁共振掃描動物研究 采用西門子3.0T超導型MR 掃描儀，配合使用3 英寸環形線圈。于癲癇模型癲癇大發作后的72 h 分別進行尾靜脈注射AMT-MNP(15 mg/kg)、P-MNP(15 mg/kg)、生理鹽水(等量)［4］。在注射前，注射后2～6 h 或24 h分別進行MR 掃描。掃描時用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，水平趴在線圈上方并固定，使線圈的中心與大鼠體部及磁場的中心保持一致。掃描序列為:T2sequences，2500TR/TE70，FOV 80 mm，層 厚2.0 mm，片層12，掃描時間6.50 min。癲癇灶橫軸面T2馳豫時間數值測量采用T2map 序列，我們使用T2mapping 軟件計算T2馳豫時間數值。

1.4 病理組織學檢查

1.4.1 腦組織冰凍切片 MRI 后的SD 大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉。待麻醉后，仰臥固定、備皮，剪開胸腔并迅速將針頭從左心尖插入，進入到升主動脈內，剪破右心耳，先用冷生理鹽水快速灌注(約30 min)，再換成4%多聚甲醛灌流。灌注充分后斷頭取腦，將其浸到4%多聚甲醛中后固定，移入30%的蔗糖浸泡沉底，行與大腦MRI 時致癲灶位置吻合位置的冰凍連續冠狀切片，切片厚5 μm，行組織病理學染色。

1.4.2 普魯士藍鐵染色Perl's iron stain 將冰凍切片復溫、涼干，蒸餾水沖洗3 min;入Perls stain，浸染15～30 min;蒸餾水2～5 min;入核固紅染色液5～10 min;自來水沖洗1～5 s;常規脫水，二甲苯透明5 min，中性樹膠封片，采用普通顯微鏡進行圖像采集。

1.4.3 尼氏染色Nissl Staining 將冰凍切片復溫、涼干;0.01 mol PBS 洗3 次;將切片置于水浴加熱至60 ℃的0.5%甲苯胺藍水溶液5～10 min，蒸餾水沖洗;70%酒精浸泡2 min，置于95%酒精中分色;置于100%酒精3 次，每次1 min;二甲苯Ⅰ、Ⅱ中透明各5 min，中性樹膠封片，采用普通顯微鏡進行圖像采集。

1.4.4 Fluoro-Jade B 染色 將冰凍切片復溫、涼干;含1% NaOH 的80% 酒精溶液搖洗5 min;70%的酒精溶液浸泡2 min，蒸餾水2 min;0.06%高錳酸鉀中震蕩10 min，蒸餾水2 min;放入0.0004%的FJB 工作液，室溫避光染色20 min，蒸餾水3 次，每次1 min;去除多余水分后，50 ℃～60 ℃烘烤15～30 min;浸入二甲苯透明2 min，用中性樹膠封片，熒光顯微鏡下采用藍色激發光(波長為450～490 nm)觀察及圖像采集。

1.5 統計學處理 本實驗所有數據均采用SPSS 19.0 統計軟件進行分析。實驗數據中，計量數據用均數±標準差()表示，組間比較用oneway ANOVA 分析，兩兩之間的比較使用LSD 檢驗。T2數值組內給藥前后比較采用配對t 檢驗。P ＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 癲癇模型磁共振掃描 T2序列結果顯示病灶高信號，多位雙側，每只大鼠我們選擇肉眼觀察明顯的一側進行統計分析。給藥前3 組之間的致癇灶T2值差異無顯著性(P ＞0.05)。經注射后各組分別與給藥前比較，Saline 組大鼠T2信號差異無顯著性(P ＞0.05)，P-MNP 組致癇灶局部輕度變暗，T2值差異無顯著性(P ＞0.05)，AMT-MNP 組致癇灶T2信號明顯變暗，T2值顯著下降，有統計學意義(P ＜0.05)(見表1、圖1)。

2.2 普魯士藍染色觀察鐵粒子在大鼠腦內的分布 鏡下可見，AMT-MNP 組和P-MNP 組腦組織內均有藍棕色顆粒分布，與Saline 組比較有統計學意義(P ＜0.05)。其中AMT-MNP 組分布較多，有統計學意義(P ＜0.01)。發現鐵顆粒多數分布在神經元細胞漿內，極少數分布在細胞周圍。Saline 組未有藍棕色顆粒分布(見表2、圖2)。

2.3 尼氏染色觀察模型大鼠海馬神經元缺失鏡下可見3 組海馬CA3區海馬神經元都出現尼氏染色著色淺，尼氏小體少，可見大量的異常形態的神經元，細胞體積變小，呈三角形或不規則形態，胞核與胞裝分界不清，尼氏染色陽性細胞計數少;3 組在數量及形態上無明顯差異，無統計學意義(P ＞0.05)(見表3)。

2.4 FJB 染色觀察急性癲癇大鼠海馬神經元損傷 鏡下發現，3 組海馬CA3區都出現大量FJB 陽性神經元，與尼氏染色的缺失部位相對應，CA1區的FJB陽性神經元相對較少。3 組比較FJB 陽性神經元數目差異無統計學意義(P ＞0.05)(見表4)。

表1 3 組癲癇模型大鼠MRI T2值變化()

表1 3 組癲癇模型大鼠MRI T2值變化()

給藥前組間比較P ＞0.05;與給藥前比較* P ＜0.05;與給藥前比較#P ＞0.05

表2 3 組大鼠腦組織鐵顆粒分布數目()

表2 3 組大鼠腦組織鐵顆粒分布數目()

與Saline 組比較* P ＜0.05;與Saline 組比較#P ＜0.01;與PMNP 組比較ΔP ＜0.01

表3 尼氏染色各組大鼠海馬CA3區神經元數目()

表3 尼氏染色各組大鼠海馬CA3區神經元數目()

與Saline 組比較* P ＞0.05;與P-MNP 組比較#P ＞0.05

表4 FJB 染色各組大鼠海馬CA3區FJB 陽性細胞數()

表4 FJB 染色各組大鼠海馬CA3區FJB 陽性細胞數()

與Saline 組比較* P ＞0.05;與P-MNP 組比較#P ＞0.05

3 討論

難治性顳葉癲癇的早期靶向定位與診斷是近年來癲癇領域研究的熱點，是提高患者生存率、改善生活質量的關鍵所在。隨著分子影像學的深入研究以及納米粒子制備技術的不斷發展，功能性MNP 在磁共振成像技術下進行病變部位的靶向檢測已經深入神經系統疾病。我們設想通過匹羅卡品誘導顳葉癲癇模型，注射AMT-MNP 后經MRI 掃描，探討其對于顳葉癲癇急性期致癇灶的靶向定位與早期診斷價值。我們發現功能性MNP 能夠在癲癇大鼠MRI 上表現出特定的腦區域。影像學結合組織病理學證實，MNP 能夠透過急性期癲癇模型大鼠BBB［5］。其原因可能是多方面的，首先，癲癇本身所致的炎癥反應就會改變BBB 的功能，如破壞緊密連接的完整性，可增強血管內皮細胞胞飲作用等。Michalak Z等通過研究就發現癲癇持續狀態后BBB 通透性增加［6］。其次，可能與MNP 本身特有的納米效應(微小尺寸)有關。此外，MNP 的超順磁性特性在MR中表現出的獨特的功能也是原因之一。然而MNP能否通過正常腦組織BBB 仍需要進一步研究。本實驗還發現注射AMT-MNP 后其可被腦實質攝取，并在致癇灶中呈現信號負增強。由于MNP 的超順磁性在外加磁場的作用下，強烈地影響顆粒周圍的水分子中氫質子的弛豫過程，同時能更為有效地縮短T2時間，因此超順磁納米顆粒使病灶表現出信號負增強變化［7］。我們比較了注射生理鹽水、P-MNP和AMT-MNP 后對癲癇灶MRI 的強化效果，發現Saline 組致癇灶T2WI 信號無明顯改變，而P-MNP 組和AMT-MNP 組有不同程度的下降。比較之下，AMT-MNP 組信號下降明顯，表現出其對致癇灶的靶向性。原因是在癲癇病理情況下，AMT 通過犬尿氨酸路徑代謝致使致癇灶高攝取AMT，從而提高了氧化鐵納米粒子的有效結合，使更多的鐵顆粒滯留在致癇灶內。對于P-MNP 而言，致癇灶對其也有一定的結合和攝取，可能和癲癇中BBB 的通透性有所增加以及MNP 的超順磁性有關。普魯士藍染色顯示鐵顆粒在與MRI 掃描相應的致癇灶中聚集，AMTMNP 組鐵顆粒的聚集較P-MNP 組多，這就與MRI掃描T2WI 值的變化結果一致，進一步的支持我們的假設。尼氏染色和FJB 染色結果顯示致癇灶中海馬神經元的缺失情況，將3 組結果進行比較，發現注射功能性MNP 后，致癇灶神經元的病理變化并無顯著改變，間接表明MNP 在腦組織內無明顯毒性作用。關于這些粒子在人體內的新陳代謝，藥理學研究表明這些MNP 的鐵分子通過溶酶體溶解，葡聚糖則主要通過腎臟排泄［8］。Muldoon 等［9］則做了磁性納米粒子的毒理學研究，發現這些粒子并未使動物腦細胞發生病理變化以及髓鞘的改變。我們相信隨著納米生物等技術的發展，MNP 必將會顯示出更小的毒副作用從而為其臨床應用奠定良好基礎。綜上所述，功能性的MNP 作為一種新型的MRI 對比劑，可以透過BBB 并在急性癲癇致癇灶內顯像，AMTMNP 明顯降低急性癲癇的MRI T2信號強度，起到了靶向定位致癇灶的作用，為靶向納米探針可用于臨床對疾病的定位、診斷及治療奠定了基礎。初步證實了功能性MNP 對腦組織無明顯毒副作用，為臨床應用提供了安全保障。但是本實驗沒有就納米探針對緘默期及慢性期癲癇在MRI 的顯像進行研究，而且本實驗只是對少量樣本進行研究，所以仍需要更深入的研究。

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［3］Akhtari M，Bragin A，Moats R，et al.Imaging brain neuronal activity using functionalized magnetonanoparticles and MRI［J］.Brain Topogr，2012，25(4):374-388.

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［6］Michalak Z，Sano T，Engel T，et al.Spatio-temporally restricted bloodbrain barrier disruption after intra-amy-gdala kainic acid-induced status epilepticus in mice［J］.Epilepsy Res，2013，103(2/3):167-179.

［7］Jun YW，Lee JH，Cheon J.Chemical design of nanoparticle probea for high-peformance magnetic resonance imaging［J］Angew Chem int Ed，2008，47(28):5122-5135.

［8］Islam T，Wolf G.The pharmacokinetics of the lymphotropic nanoparticle MRI contrast agent ferumoxtran-10［J］.Cancer Biomark，2009，5(2):69-73.

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圖1 急性期癲癇模型大鼠的磁共振T2加權圖像

圖2 各組急性癲癇模型大鼠普魯士藍染色情況