梨屬野生種質資源SRAP—PCR反應體系優化研究

梁婷婷　馬燕　臧德奎

摘要：采用正交直觀分析法和新復極差法對影響梨屬野生種質資源SRAP-PCR反應的5種因素（Mg2+濃度、dNTPs濃度、引物濃度、Taq DNA聚合酶、模板DNA）4個水平進行優化篩選。結果表明，優化后的梨屬SRAP-PCR反應體系為25 μL，包括10×PCR buffer 2.5 μL，2.0 mmol/L Mg2+，200 μmol/L dNTPs，0.4 μmol/L引物，1.5 U Taq酶，60 ng模板DNA。

關鍵詞：梨屬；SRAP-PCR；正交直觀分析法；新復極差法

中圖分類號：S661.201文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）12-0007-04

目前相關序列擴增多態性（Sequence-related amplified polymorphism， SRAP）技術已在多種果樹、蔬菜以及大田作物中得以使用，并以其多態性豐富、簡單、易測序[1]等優點應用于遺傳多樣性分析[2]、遺傳圖譜構建[3]、親緣關系分析、種質資源鑒定以及比較基因組學等諸多研究領域。

正交PCR試驗是基于統計學原理，研究各影響因素不同水平間交互作用的一種方法[4]，具有均衡分散和整齊可比的特點，可以簡便、快速地找到反應體系的最佳組合[5]。正交直觀分析法正是基于PCR正交設計試驗的一種結果判斷方法，即根據擴增條帶的明亮度、特異性及數量的多少進行不同的分數判斷，分數越高則表明擴增效果越好。新復極差法（SSR）是方差分析的進一步分析，用于多種因素對某一結果影響的各個因素之間的顯著性分析。

目前基于正交設計法的SRAP-PCR技術已在辣椒、石榴等物種的相關研究中得以應用[6，7]。本試驗采用正交設計法對梨屬野生種質資源SRAP-PCR反應體系進行優化，并通過正交直觀分析法和新復極差法，更直觀快速地找到梨屬SRAP-PCR反應體系的最佳組合，以期為梨屬野生種質資源的開發利用與保護提供基礎技術支持。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料為秋子梨（Pyrus ussuriensis）、褐梨（Pyrus phaeocarpa）、河北梨（Pyrus hopeiensis）、杜梨（Pyrus betulaefolia）、嶗山梨（Pyrus trilocularis）。4月中旬于山東嶗山、蒙山等地采集用于提取DNA的幼葉樣品，幼葉采集后硅膠干燥保存。

1.2試驗方法

1.2.1試劑和儀器DNA擴增采用Bio-Rad PCR儀，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后在北京六一WD-9403CS型紫外儀上采集圖像。試驗所用引物由TaKaRa合成；用于PCR反應的Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和Buffer均購自TaKaRa公司。

1.2.2樣品基因組DNA的提取梨屬樣品基因組DNA的提取采用改良的CTAB法[8]。基因組DNA質量的檢測采用瓊脂糖凝膠電泳法和核酸蛋白分析儀。

1.2.3PCR反應體系的正交試驗試驗采用L16（45）正交表設計，對影響擴增結果的5因素進行4水平共16個組合的篩選，各體系模板均為秋子梨樣品，所選引物為隨機Me5/Em11（序列見表3）組合，PCR反應體系總體積設為25 μL，每組合按其濃度計算加樣量，并包含10×PCR buffer 2.5 μL，不足部分用超純水補足。試驗各因素水平見表1，正交試驗設計見表2。

PCR反應擴增程序：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環5次；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環30次；72℃延伸7 min，4℃保存。擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離，20 μL上樣，電壓120 V電泳90 min，電泳緩沖液為1×TAE，經溴化乙錠（EB）染色后，在紫外儀上采集圖像。

PCR擴增結果分析參照何正文等[9]的直觀分析法，即對各組合擴增出來的條帶分別進行分數判定，分數等級設為3、2、1、0分。判定評分后再參照王軍[7]、劉萌芽[11]等的方法，運用新復極差法對試驗數據進行分析。

1.2.4體系穩定性檢測隨機選用6對引物組合對褐梨、杜梨、河北梨、嶗山梨 4個野生種進行PCR擴增，經電泳觀察結果。所用引物序列見表3。

2結果與分析

2.1基因組DNA電泳檢測

由圖1可知，梨屬樣品基因組DNA電泳檢測

結果良好，條帶清晰明亮。核酸蛋白分析儀檢測結果顯示，A260/A280值皆在1.80至2.00之間，說明該梨屬樣品基因組DNA提取純度和濃度都較高，符合PCR試驗的要求。

2.2SRAP-PCR反應體系優化結果

試驗中正交體系的PCR產物電泳結果見圖2。通過新復極差法[10]對圖2中的16個組合（各2次重復）的擴增結果進行分析，最終得到各因素不同濃度水平的總分值、平均分值和極差值，極差分析結果見表4。

2.2.1Mg2+濃度優化分析Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。適宜濃度一般在0.5～2.5 mmol/L之間。本試驗中，Mg2+濃度為1.5 mmol/L時，平均分值最低為8.75分；為2.0 mmol/L時，平均分值最高為12.25分。說明梨屬SRAP-PCR反應中Mg2+的適宜濃度為2.0 mmol/L。

2.2.2dNTPs濃度優化分析由表4可以看出，dNTPs濃度為100 μmol/L時，反應產量低，平均分值也低至7.50分；濃度為200 μmol/L時，平均分值達最高值12.25分。說明梨屬SRAP-PCR反應的適宜dNTPs濃度為200 μmol/L。

2.2.3引物濃度優化分析引物濃度為0.1 μmol/L時，產量及平均分值都最低，為8.25分；隨引物濃度增加至0.4 μmol/L時，平均分值達最高12.75分。說明梨屬SRAP-PCR反應的引物適宜濃度為0.4 μmol/L。

2.2.4Taq DNA聚合酶濃度優化分析Taq DNA聚合酶為2.0 U時，平均分值最低，7.50分；為1.5 U時，平均分值最高，11.75；說明1.5 U Taq DNA聚合酶濃度為梨屬SRAP-PCR反應的適宜濃度。

2.2.5模板用量優化分析模板DNA用量為80 ng時，平均分值最低為8.60分，可能影響PCR反應的特異性；當模板DNA用量下降到60 ng時，平均得分增至最高值12.50分。說明梨屬SRAP-PCR反應的模板適宜用量為60 ng。

綜上分析后得到的最佳反應組合為Mg2+濃度為2.0 mmol/L，dNTPs濃度為200 μmol/L，引物濃度為0.4 μmol/L，Taq聚合酶為1.5 U，模板DNA用量為60 ng。此組合即為體系中第10個處理，由圖2可知，該組合擴增結果清晰，條帶明亮、無重疊，適于進行SRAP-PCR試驗。

參照劉萌芽等[11]的方法，分析了本試驗中各因素對SRAP-PCR反應的影響程度。由表4可知，dNTPs濃度的極差值最大，平均分高達4.75，表明dNTPs對梨屬SRAP-PCR反應的影響最為顯著；次之為引物濃度；影響程度居中的因素為Taq DNA聚合酶；Mg2+濃度和模板DNA的影響程度最小。

2.3最優體系的穩定性檢測

采用優化篩選后的SRAP-PCR反應體系結合隨機抽取的6對引物組合（Me1/Em16， Me1/Em18， Me2/Em10， Me5/Em10， Me6/Em10， Me6/Em13）對褐梨、杜梨、河北梨、嶗山梨 4個野生種進行擴增，結果顯示，除第四對引物外，4個梨品種基因組均能擴增出數量不等的條帶（圖3），表明該最優體系可滿足相關試驗的要求，有望為進一步的研究提供基礎。

3結論與討論

目前在梨屬SRAP的相關研究中，張妤艷等[12]對其影響因素進行過篩選，但缺乏對模板DNA濃度的分析；僅董星光等[1]利用正交優化試驗研究過梨SRAP-PCR反應的最適體系。由于PCR擴增的各種不確定性，體系中任何一項細微差異都可能直接影響試驗結果，所以隨著野生種質資源關注度的提高，有必要對梨屬野生種質資源SRAP-PCR體系再優化，以確保資源開發研究的順利進行。

本研究采用正交直觀分析法和新復極差法對梨屬野生種質資源SRAP-PCR反應體系進行了優化。最終得出反應的最優組合為：25 μL的總反應體系中含10×PCR Buffer 2.5 μL，Mg2+ 2.0 mmol/L，dNTPs 200 μmol/L，引物 0.4 μmol/L，Taq 酶1.5 U，模板DNA 60 ng。利用該體系結合隨機抽取的6對引物組合對4份野生梨屬材料進行穩定性驗證，擴增結果穩定。因此本研究獲得的梨屬野生種質資源SRAP-PCR優化體系，可以為今后梨屬野生資源的進一步研究提供一定的應用基礎。

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