大白菜、甘藍和黑芥CBL1基因的比較分析

李化銀+姜常松+張一卉+高建偉+李利斌+曹齊衛

摘要：CBL1基因在植物非生物逆境應答及發育過程中具有重要功能。本試驗在解析大白菜、甘藍和黑芥CBL1的基礎上，對它們進行了系統地比較分析，為進一步研究CBL1基因在蕓薹屬植物中的分子進化和功能奠定基礎。

關鍵詞：蕓薹屬；CBL1；結構；進化；順式元件

中圖分類號：S634.1+S635.1+S637.1文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）12-0001-03

十字花科蕓薹屬植物具有豐富的形態類型和遺傳多樣性，是研究植物遺傳進化和形態發育的良好系統。植物CBL基因是鈣信號系統的重要組分，它起到鈣信號傳感器的作用，在植物逆境應答和生長發育中具有重要功能[1]。其中一個成員CBL1在鉀的吸收[2，3]、冷[4，5，8]和鹽脅迫應答[6～9]、ABA應答[10]、種子萌發和幼苗生長及花粉萌發[11，12]等方面具有重要功能，而且存在復雜多樣的表達調控模式[13，14]。因此解析蕓薹屬蔬菜中的CBL1基因對于研究它的遺傳分化和在逆境應答及生長發育中的功能，進而用于蔬菜抗逆遺傳改良具有重要意義。本試驗利用比較基因組學的方法，從蕓薹屬大白菜、甘藍和黑芥中鑒定出4個CBL1基因，并對它們進行了全面的比較分析。

1研究方法

利用擬南芥CBL1基因序列在大白菜基因組數據庫中（BRAD：http：//brassicadb.org/brad/）搜索比對，尋找大白菜CBL1基因序列；在GenBank中（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）搜索甘藍和黑芥的基因組序列，尋找甘藍和黑芥CBL1基因序列。對鑒定出的CBL1基因進行結構和遺傳進化分析，并對它們啟動子序列中的順式元件進行預測。結構分析利用GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）在線進行；遺傳進化分析利用MEGA 4.1進行，采用Bootstrap test-Neighbor Joining方法，重復500次運算；順式元件預測采用PlantCARE軟件進行在線分析。亞細胞定位預測在WoLF PSORT （http：//wolfpsort.org/）中進行。

2結果與分析

2.1大白菜、甘藍和黑芥CBL1基因的特征分析

通過數據庫搜索和序列比對，在大白菜基因組中鑒定出兩個CBL1基因，在甘藍和黑芥中各鑒定出一個CBL1基因。其預測的編碼區序列都是642 bp；亞細胞定位預測顯示這幾個CBL1基因的表達產物都定位在細胞核中（表1）。基因結構分析顯示它們都有8個外顯子，而且不同外顯子的大小在蕓薹屬三個物種間非常保守（圖1）：第一個外顯子79 bp，第二個83 bp，第三個60 bp，第四個109 bp，第五個53 bp，第六個81 bp，第七個113 bp，第八個64 bp。

序列比對分析顯示，大白菜、甘藍和黑芥CBL1基因8個外顯子（從第一個到第八個）的核苷酸序列一致性分別為：97.47%、97.89%、95.42%、95.41%、97.17%、98.15%、98.45%和94.53%。由此可見，大白菜、甘藍和黑芥CBL1基因不僅在基因結構上保守，在基因序列上也很保守。

2.2大白菜、甘藍和黑芥CBL1基因的遺傳進化分析

遺傳進化分析（圖2）顯示，大白菜兩個CBL1基因與甘藍和黑芥CBL1的關系比與擬南芥CBL1的關系近。Bra012655和BoCBL1首先聚在一起，Bra040169優先和BnCBL1聚在一起，然后再和AtCBL1聚在一起。序列比對分析發現，Bra040169和Bra012655編碼蛋白的序列一致性為96.71%，Bra040169和BnCBL1編碼蛋白的序列一致性為99.06%，Bra012655和BoCBL1編碼蛋白的序列一致性為98.12%，Bra040169和BoCBL1編碼蛋白的序列一致性為95.77%，Bra012655和BnCBL1編碼蛋白的序列一致性為97.65%。Bra012655、Bra040169、BnCBL1和BoCBL1與擬南芥CBL1編碼蛋白的序列一致性分別為78.40%、77.00%、77.93%和77.93%。

2.3大白菜、甘藍和黑芥CBL1基因的順式調控元件和功能預測

大白菜、甘藍和黑芥CBL1基因的順式調控元件分析結果（表2）顯示，它們都含有多個逆境和激素應答順式調控元件，且不盡相同：BoCBL1和BnCBL1各含有1個ABA應答元件，Bra040169和Bra012655各含有2個ABA應答元件；BoCBL1、Bra040169和Bra012655都含有1個茉莉酸甲酯應答元件CGTCA-motif，BnCBL1含有3個茉莉酸甲酯應答元件；大白菜、甘藍和黑芥四個CBL1同源基因中只有Bra040169含有1個乙烯應答元件；BoCBL1含有4個赤霉素應答元件GARE-motif，BnCBL1和Bra012655各含有2個赤霉素應答元件，而Bra040169只有1個赤霉素應答元件；BnCBL1和Bra040169各有1個熱脅迫應答元件，其余兩個基因不含有；只有BnCBL1含有1個低溫應答元件；BnCBL1和BoCBL1各有1個干旱應答元件MBS，Bra040169有3個，Bra012655有2個；BoCBL1有1個逆境和防衛反應元件TC-rich repeats，BnCBL1和Bra012655各有2個，Bra040169有3個；BoCBL1有3個水楊酸應答元件TCA-element，BnCBL1有4個，Bra012655有1個，而Bra040169沒有水楊酸應答元件。以上結果說明：①大白菜、甘藍和黑芥CBL1基因可能在功能上有所分化；②大白菜、甘藍和黑芥CBL1基因可能不僅參與非生物逆境應答，也參與生物逆境應答過程，因為茉莉酸甲酯和水楊酸是重要的抗病激素，在生物逆境應答中具有重要功能。

3結論

本試驗對蕓薹屬植物大白菜、甘藍和黑芥的CBL1基因進行了系統的比較分析，結果顯示，這三種植物的CBL1基因在序列和結構上非常保守，都含有8個外顯子，且這8個外顯子的大小及序列也非常保守，它們的序列一致性在94%以上，編碼蛋白的序列一致性在95%以上，其編碼的蛋白都預測定位在細胞核中。分析還顯示，這些CBL1基因上游序列中都含有多個逆境和激素應答元件，且含有的順式調控元件的種類和數量不完全一致，說明這些基因可能執行某些相似的功能但又有所分化。

參考文獻：

[1]Weinl S， Kudla J. The CBL-CIPK Ca2+-decoding signaling network： function and perspectives [J]. New Phytologist， 2009， 184（3）： 517-528.

[2]Cheong Y H， Pandey G K， Grant J J， et al. Two calcineurin B-like calcium sensors， interacting with protein kinase CIPK23， regulate leaf transpiration and root potassium uptake in Arabidopsis [J]. Plant Journal， 2007， 52（2）： 223-239.

[3]Xu J， Li H D， Chen L Q， et al. A protein kinase， interacting with two calcineurin B-like proteins， regulates K+ transporter AKT1 in Arabidopsis[J]. Cell， 2006， 125： 1347-1360.

[4]Li Z Y， Xu Z S， He G Y， et al. The voltage-dependent anion channel 1 （AtVDAC1） negatively regulates plant cold responses during germination and seedling development in Arabidopsis and interacts with calcium sensor CBL1 [J]. International Journal of Molecular Science， 2013， 14（1）：701-713.

[5]Huang C， Ding S， Zhang H， et al. CIPK7 is involved in cold response by interacting with CBL1 in Arabidopsis thaliana [J].Plant Sci.， 2011， 181（1）：57-64.

[6]Shi S， Chen W， Sun W. Comparative proteomic analysis of the Arabidopsis cbl1 mutant in response to salt stress [J]. Proteomics， 2011， 11（24）： 4712-4725.

[7]Du W， Lin H， Chen S， et al. Phosphorylation of SOS3-like calcium-binding proteins by their interacting SOS2-like protein kinases is a common regulatory mechanism in Arabidopsis [J]. Plant Physiology， 2011， 156（4）：2235-2243.

[8]Cheong Y， Kim K， Pandey G， et al. CBL1， a calcium sensor that differentially regulates salt， drought， and cold responses in Arabidopsis [J]. Plant Cell， 2003，15（8）：1833-1845.

[9]Albrecht V， Weinl S， Blazevic D， et al. The calcium sensor CBL1 integrates plant responses to abiotic stresses [J]. Plant Journal， 2003， 36（4）：457-470.

[10]Guo Y， Xiong L， Song C P， et al. A calcium sensor and its interacting protein kinase are global regulators of abscisic acid signaling in Arabidopsis [J]. Developmental Cell， 2002， 3（2）： 233-244.

[11]Li Z Y， Xu Z S， Chen Y， et al. A novel role for Arabidopsis CBL1 in affecting plant responses to glucose and gibberellin during germination and seedling development [J]. PLoS One， 2013，8（2）：e56412.

[12]Mhs A， Steinhorst L， Han J P， et al. The calcineurin B-like Ca2+ sensors CBL1 and CBL9 function in pollen germination and pollen tube growth in Arabidopsis[J]. Molecular Plant， 2013， 6（4）：1149-1162.

[13]Batistic O， Sorek N， Schültke S， et al. Dual fatty acyl modification determines the localization and plasma membrane targeting of CBL/CIPK Ca2+ signaling complexes in Arabidopsis[J].Plant Cell， 2008， 20（5）：1346-1362.

[14]Drerup M M， Schlücking K， Hashimoto K， et al. The Calcineurin B-like calcium sensors CBL1 and CBL9 together with their interacting protein kinase CIPK26 regulate the Arabidopsis NADPH oxidase RBOHF[J]. Molecular Plant， 2013， 6（2）：559-569.