利用多重PCR技術檢測羊肉中摻雜狐貍肉的方法研究

張全芳+馬德源+劉艷艷+梁水美+楊雪+馮夢秋+史學芹+卞如如+李燕+岳鳴鳴+步迅

摘要：本研究根據山羊、綿羊和狐貍線粒體16S rRNA基因間序列差異，設計特異性引物，其擴增片段大小分別為401、450 bp和300 bp，從而可在一個PCR反應中同時鑒別山羊、綿羊和狐貍三種源性成分，檢測靈敏度高。

關鍵詞：多重PCR；山羊；綿羊；狐貍；源性鑒定

中圖分類號：Q819+R155文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）12-0004-04

隨著人們生活水平的不斷提高，對肉產品的需求量越來越大。但肉制品摻雜摻假的現象屢見不鮮，摻假的方式包括摻兌、混入、抽取、假冒等手段。例如一些不法商家或個人為了追求自身利益用低價劣質的肉冒充高價優質的肉，尤以摻雜異種肉（如用雞肉冒充豬肉，豬肉冒充牛羊肉等）的造假行為最為常見[1]。2013年5月份，公安部公布的一起食品安全犯罪案件顯示，不法商家將未經檢驗的狐貍、水貂、老鼠等肉品摻雜至羊肉中，銷往上海等多地的農貿市場。這些摻假肉類微生物嚴重超標，投入市場嚴重影響了消費者的健康。

目前，對肉類的鑒別方法主要有：顯微鏡觀察法，通過肉制品的味道、色澤、肉類的紋理等進行肉類來源的判別；蛋白質檢測法，如等電聚焦電泳法、免疫法、酶聯免疫吸附實驗（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、色譜法；DNA檢測法，如核酸探針雜交、限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應（Polymerase chain reaction-fragment length polymorphism，PCR-RFLP）分析、DNA 指紋分析和PCR 特異擴增[2]。基于顯微鏡及蛋白質的鑒別方法需要豐富的經驗，且具有極大的主觀性，主要用于生鮮肉類的鑒別。在熟肉制品中，蛋白質遇高溫易變性，利用蛋白質檢測法無法靈敏地檢測其肉質種源。除此之外，這些方法存在成本高、工作量大、對檢測對象要求高等缺點。分子生物學鑒定中的DNA雜交法費時、昂貴且復雜，而PCR方法由于反應時間短，具有較高靈敏性、特異性和可鑒別性，已成為肉制品品種鑒別中最常用的方法[2，3]。目前，根據線粒體基因組DNA序列差異設計物種特異性引物建立的PCR與實時熒光PCR方法已有大量報道，且進入了中國權威的檢測技術標準[4，5]。PCR方法可以解決傳統方法中由于蛋白質變性而失能的困難，多重PCR技術具有高效性、系統性和經濟簡便性的特點，使肉類及其制品種類鑒定成為可能[6]。

本研究根據動物線粒體16S rRNA基因的差異性位點，設計特異性引物，通過優化PCR反應體系，建立了正向引物共用、反向引物特異的PCR反應體系，一次PCR反應可同時擴增出三個不同物種（綿羊、山羊、狐貍）的特異性片段。該方法具有較高的靈敏度和準確度，且操作簡單易行，有望成為常規檢測的有效方法。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試材料用于陽性對照的山羊肉和綿羊肉（生肉、熟肉制品）樣品及待檢測樣品購自濟南超市及市場，狐貍肉來自蓬萊市新港街道辦事處劉家旺村狐貍養殖場。

1.1.2主要試劑和儀器動物組織基因組DNA提取試劑盒（DP304-02，天根）；2×Taq PCR Master Mix （TaKaRa），DNA Marker（DL2000，天根）；引物由上海Invitrogen公司合成。儀器：PCR擴增儀（Veritee96-well，TaKaRa公司）；核酸電泳儀（Power PA 200，Bio-Rad公司）；凝膠成像儀（Alpha Imager EP， Cell Bioscience公司）；臺式高速冷凍離心機（5430R，Eppendorf公司）。

1.1.3PCR引物的設計根據山羊、綿羊和狐貍線粒體16S rRNA基因序列（GenBank登錄號分別為AB044308.1、HM236185.1、DQ334815.1）設計并確定各自特異引物， 三個物種的編號分別為：山羊-SY、綿羊-MY、狐貍-H，具體信息見表1。

1.2試驗方法

1.2.1肉類總DNA的提取使用滅菌打孔器，采用三層五點取樣法在山羊肉、綿羊肉、狐貍肉和待檢樣品的不同部位取樣，置于滅菌研缽中剪碎，加入液氮充分研磨。按照試劑盒說明進行基因組DNA提取。50 mg樣品的總DNA均溶解于100 μL TE 緩沖液中，于OD260/OD280測定吸光度值，計算DNA濃度和純度。

1.2.2PCR反應體系及擴增條件反應體系（25 μL）為：rTaq（2.5 U/μL）0.15 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2.0 μL，SYS1 （2 μmol/L） 2.0 μL、SYA （2 μmol/L） 1.5 μL、MYA （2 μmol/L） 1.0 μL、HA （2 μmol/L）各2.0 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 12.85 μL。擴增條件為：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環；72℃延伸10 min，4℃保存。

1.2.3引物特異性試驗使用上述反應體系及條件，分別對3種目標肉類和兩兩等比例混合最終完全混合DNA標本及非目標肉類等材料（牛肉、豬肉、雞肉、鴨肉、小麥）的DNA標本進行PCR擴增，對山羊、綿羊、狐貍三重PCR引物的特異性進行驗證與比較，重復2次。

1.2.4摻雜肉類敏感性試驗將山羊、綿羊和狐貍肉的全基因DNA分別用分光光度計將濃度定量到10 ng/μL，將山羊肉/狐貍肉、綿羊肉/狐貍肉按照表2的比例進行混勻，參照上述PCR反應體系及反應條件進行擴增檢測，重復2次。

2結果與分析

2.1山羊肉、綿羊肉和狐貍肉三重PCR引物特異性試驗

PCR結果見圖1，山羊肉、綿羊肉和狐貍肉分別得到401、450、300 bp的單一條帶，無非特異性雜帶；山羊肉/綿羊肉、山羊肉/狐貍肉、綿羊肉/狐貍肉、山羊肉/綿羊肉/狐貍肉的混合DNA擴增條帶清晰，能夠清楚分辨不同肉類來源的條帶；而小麥、牛肉、豬肉、雞肉、鴨肉及空白對照均沒有擴增出條帶，說明引物的特異性強。

2.2山羊肉、綿羊肉和狐貍肉三重PCR摻雜肉類敏感性試驗

將狐貍肉DNA分別按1%、2%、4%、5%、10%、20%、40%比例與綿羊肉DNA和山羊肉DNA混合，按照上述方法進行PCR擴增并電泳檢測擴增效果。從圖2可以看出，在綿羊肉混合狐貍肉檢測試驗中，該引物對能在山羊肉中特異性地檢測出含量高于2%的狐貍肉成分。從圖3可以看出，在山羊肉混合狐貍肉檢測試驗中，該引物對能在山羊肉中特異性地檢測出含量高于20%的狐貍肉成分。結果顯示狐貍肉和綿羊肉摻雜在一起的檢測敏感性要比山羊肉和狐貍肉摻雜在一起的檢測敏感性高。

3討論

在動物源性成分鑒定中，多重PCR技術是較為常用的鑒定方法之一。多重PCR是在同一PCR反應體系里加上兩對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應。以多重PCR為基礎的肉類成分鑒別技術具有檢測通量高、儀器設備簡單、操作方便且檢測費用低的優點，它解決了傳統方法中由于蛋白質變性而失能的困難，還可以鑒定肉加工類樣品[7，8]。

本試驗在參考前人研究的基礎上，基于物種間線粒體16S rRNA基因的序列差異，建立了三種肉類成分快速檢測的多重PCR方法。本方法可以特異地分辨出綿羊肉、山羊肉、狐貍肉三種不同的肉類源性成分，在綿羊肉中可以分辨出含量高于2%的狐貍肉，在山羊肉中只可以分辨出含量高于20%的狐貍肉，可能是由于山羊肉和狐貍肉基因組存在競爭性擴增或者引物的設計及靶序列的選擇不當等降低了其靈敏度。

目前，針對鴨肉、豬肉、雞肉和馬肉等可能摻假肉類的檢測已經成熟[9～11]，對越來越復雜的羊肉摻假現象，相關檢測技術也在不斷發展。未來動物源性食品檢測技術的研究將致力于提高靈敏度和特異性，開發各種肉類配套的試劑盒產品，這樣對于各種動物源性肉類及肉制品的檢測將會更加系統快捷。

參考文獻：

[1]劉帥帥，李宏，羅世芝，等. PCR 技術在肉類摻假檢驗中的應用進展[J]. 食品安全質量檢測學報， 2011， 2（6）： 280-284.

[2]王建昌，王金鳳，陳瑞春，等. 鴨肉冒充牛羊肉的分子生物學檢測[J].肉類研究， 2012， 6（21）：20-23.

[3]王可，張玉玉，崔緒奎，等.微衛星分子標記鑒別羊肉真偽方法的建立及應用[J].山東農業科學，2014，46（6）：16-18.

[4]何瑋玲， 張馳， 楊靜，等. 食品中4種肉類成分多重PCR的快速鑒別方法[J].中國農業科學，2012， 45（9）：1873-1880.

[5]尚柯，段慶梓，張玉，等. 多重PCR法用于畜肉源性鑒定的研究[J].食品工業科技，2013，34（8）：83-96.

[6]曾少靈， 秦智鋒， 阮周曦，等. 多重實時熒光PCR檢測牛、山羊和綿羊源性成分[J]. 生物工程學報， 2009， 25（1）： 139-146.

[7]王麗媛， 葉建榮， 李興民，等. PCR技術檢測食品與飼料中動物源成分[J]. 保鮮與加工， 2006， 6（4）：33-36.

[8]羅家琴，王加啟，卜登攀，等. 飼料中牛、羊、豬、雞源性成分的PCR檢測方法及其應用[J].中國農業科學，2008， 41（7）：2112-2119.

[9]Matsunaga T， Chikuni K， Tanabe R， et al. A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay [J]. Meat Science， 1999， 51（2）：143-148.

[10]馮海永， 韓建林. 羊肉產品中若干動物源性成分的七重PCR檢測技術應用研究[J]. 中國畜牧獸醫， 2010，37（9）：85-90.

[11]李杰，喬緒穩，余興龍，等. 快速鑒定豬肉和牛肉多重PCR方法的建立及初步應用[J]. 湖南畜牧獸醫， 2011 （2）：13-15.