環(huán)介導等溫擴增技術快速檢測肉中沙門氏菌

龐心怡 ，滿朝新，趙玥明，周文琦，閆天文，柴云雷，韓建春，姜毓君，

(1東北農(nóng)業(yè)大學食品學院/乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030;2 東北農(nóng)業(yè)大學國家乳業(yè)工程技術研究中心，哈爾濱 150086)

沙門氏菌(Salmonella)在環(huán)境中廣泛存在，是一種引起食源性疾病的重要致病菌，能引起人胃腸炎、傷寒、敗血癥等癥狀［1］。最近的一項美國食源性疾病暴發(fā)的報告中指出，沙門氏菌是最常見的細菌性病原體，占所有細菌性食物中毒的52%［2］。近年來在我國，沙門氏菌也是微生物引起食源性疾病中最主要的病原菌之一，占17.19%［3］。沙門氏菌菌屬類型多樣，抗原復雜，目前已分離出2 500 多個血清型。許多動物性食品都是沙門氏菌污染的主要來源，其中肉類更為常見［4］。目前檢測沙門氏菌的傳統(tǒng)方法費時費力，PCR 為代表的分子生物學方法需要昂貴儀器和復雜設備，不能達到現(xiàn)代檢測對于高效、簡便、低成本的要求［5］。近年來，環(huán)介導等溫擴增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)以其快速、高效、靈敏和恒溫擴增的特點，成為受到關注的核酸擴增的新技術之一。LAMP 技術利用具有鏈置換活性的Bst DNA 聚合酶，通過對靶基因的6 個區(qū)段設計的4 條特異性的引物，在恒溫(60～65℃)、短時間(1h)條件下達到對目的基因的高效擴增［6］。由于LAMP 的擴增產(chǎn)物是靶基因的一系列反向重復形成的類似花椰菜結(jié)構(gòu)，電泳呈現(xiàn)的是不同片段大小組成的階梯式圖譜，也可以根據(jù)生成的焦磷酸鎂沉淀通過肉眼來判斷反應是否發(fā)生［7］。本研究擬利用環(huán)介導等溫擴增技術檢測肉中的沙門氏菌，并與傳統(tǒng)PCR 方法比較，驗證其靈敏度和特異性，為這一方法的推廣提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

細菌基因組、DNA 提取試劑盒，北京天根生物技術有限公司;Bst 大片段DNA 聚合酶New England Biolabl;dNTP，購自于Promega 公司;甜菜堿 (Betaine)，美國Sigma 公司;DNA marker，北京百泰克生物技術有限公司;瓊脂糖，西班牙Biowest 公司;溴化乙錠(EB)，購自于美國sigma 公司。Tc-25/H 型基因擴增儀，美國PCR Kin Elmer Gene Amp;UVP 凝膠成像儀，美國UVP 公司;DYY-10C 型電泳儀，北京市六一儀器廠。實驗所用菌株見表1。

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌的培養(yǎng)以及DNA 模板的提取 取沙門氏菌ATCC14028 作為標準菌株，在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中活化3 株沙門氏菌參考菌株及其他8 株非沙門氏菌菌株，在37℃條件下培養(yǎng)過夜。應用細菌基因組提取試劑盒提取處于對數(shù)生長期的細菌DNA，將得到的DNA 模板于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 LAMP 引物設計與合成 在GenBank 中查找到的決定沙門氏菌侵襲力的腸侵襲蛋白，同時也是高度保守的屬特異性基因invA 設計特異性的LAMP 引物［8］。應用Primer Explorer 4.0 引物設計軟件，得到的一套特異性引物，引物序列:FIP-CCCAGATCCCCGCATTGTTGAT

表1 實驗所用菌株

TTTTCCGCCCCATATTAT C-GCTAT，BIP-GACCATCACCAATGGTCAGCATTTTATTGGCGGTATTTCGGTGGG，F(xiàn)3 -GTTCAACAGCTGCGTCATGA，B3-CGCTATTGCCGGCATCATTA。引物由上海英俊公司合成。

1.2.3 LAMP 反應體系的建立與優(yōu)化 25μL 的LAMP 反應體系包括:2 個內(nèi)引物FIP 和BIP、2 個外引物F3 和B3、脫氧核糖核苷酸(dNTPs)、Mgcl2、甜菜堿、10 × Buffer、DNA 模板，滅菌水補足體系。將混合物在95℃加熱5min 后立即冷卻，再加入Bst DNA聚合酶1μL，在65℃恒溫60min，隨即進行酶的滅活，加熱到80℃持續(xù)2min 終止反應。選擇對LAMP 體系中的關鍵因素進行優(yōu)化，包括外引物與內(nèi)引物濃度比(1∶4、1∶6、1∶8、1∶10)、鎂離子濃度(0、1、2、3、4、5、6mmol/L)、dNTP 濃度(0.4、0.8、1.2、1.6、2、2.4mmol/L)、甜菜堿濃度 (0、0.4、0.6、0.8mmol/μL)，根據(jù)LAMP 擴增后電泳圖條帶的有無和亮度選擇最適條件，建立LAMP 反應體系。

1.2.4 LAMP 檢測沙門氏菌的靈敏度 取1mL 處于對數(shù)生長期的沙門氏菌純培養(yǎng)液，用0.85%生理鹽水進行10 倍梯度稀釋100～109倍，并采用稀釋平板法計算出初始菌液濃度為9.8 ×108CFU/mL。用試劑盒對每個稀釋度的沙門菌液提取基因組DNA，并用各個稀釋度的DNA 作為模板分別進行LAMP 和PCR 反應。取5μL 擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，在110V 電壓下電泳40min，并利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.5 LAMP 檢測沙門氏菌的特異性 按照1.2.1 步驟，提取沙門氏菌以及其他8 株非沙門氏菌的DNA，并作為LAMP 反應的模板，進行LAMP 反應，反應產(chǎn)物進行電泳驗證。

1.2.6 LAMP 檢測人工污染肉中沙門氏菌 鮮豬肉，購自當?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場，人工染菌前經(jīng)國標法確認不含有沙門氏菌。按照GB/T4789.4-2008，取25g 豬肉樣品放入盛有并225mL BPW 的無菌均質(zhì)袋中，制成1∶10 稀釋液。添加108～100CFU/mL 不同稀釋度的沙門氏菌純菌液2.5mL分別與于9 組25mL 稀釋液中，均質(zhì)后沙門氏菌濃度即為107～10－1CFU/mL，分別用試劑盒提取每一組人工污染肉漿中沙門氏菌的DNA，進行LAMP 反應。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP 反應體系的建立

通過優(yōu)化，確立的最終LAMP 反應體系為:1.6μmol/L 的FIP 和BIP，0.2μmol/L 的F3 和B3，1.6 mmol/L dNTPs，6mmol/L MgCl2，1μL 的Bst DNA 聚合酶(8U)，1mol/L 甜菜堿，2.5μL 10 × Buffer 及2μL模板。對沙門氏菌標準菌株ATCC14028 采用優(yōu)化的LAMP 體系進行擴增，電泳后如圖1，呈現(xiàn)LAMP 特有的階梯狀條帶，空白則未出現(xiàn)條帶。

圖1 沙門氏菌LAMP 檢測結(jié)果

2.2 LAMP 檢測沙門氏菌純培養(yǎng)物的靈敏度

從圖2 可見，沙門氏菌純培養(yǎng)物在稀釋到109倍時沒有條帶產(chǎn)生，本實驗建立的LAMP 方法對沙門氏菌純培養(yǎng)物的檢出限為9.8×100CFU/mL。對比圖3 可知，PCR法檢測沙門氏菌的靈敏度是9.8×102CFU/mL，因此，本實驗建立的LAMP 法的檢出限是PCR 的100 倍。

圖2 LAMP 檢測沙門氏菌純菌靈敏度電泳圖

圖3 PCR 檢測沙門氏菌純菌的靈敏度電泳圖

2.3 LAMP 檢測沙門氏菌的特異性

如圖4 所示，4 株沙門氏菌的泳道均有LAMP 特異性的條帶產(chǎn)生。其他8 株非沙門氏菌均呈陰性反應，沒有出現(xiàn)特異性的階梯形條帶。

2.4 LAMP 檢測人工污染肉漿中沙門氏菌的靈敏度

按照1.2.6 所示，人工污染肉漿中沙門氏菌的濃度為9.8×107～9.8×10－1CFU/mL。LAMP 檢測人工污染肉中沙門氏菌的檢出限為9.8×101CFU/mL (圖5)。

3 討論

圖4 LAMP 特異性電泳圖

圖5 LAMP 檢測人工污染肉中沙門氏菌的靈敏度電泳圖

目前，分子生物學的發(fā)展帶動了各種基于核酸擴增的方法在檢測致病菌方面的發(fā)展。沙門氏菌的分子生物學檢測方法主要包括PCR 以及熒光定量PCR，但是復雜昂貴的儀器和對檢測人員較高的技術要求使得這一技術不適合在基層推廣使用和現(xiàn)場的快速檢測［9］。本實驗建立的檢測肉中沙門氏菌的LAMP 方法快速簡便，無需復雜的熱循環(huán)儀，普通的水浴鍋就可以滿足溫度的要求［10］。由于LAMP 的引物是針對靶基因的6 個區(qū)段設計的，因此特異性很強［11］。無論是沙門氏菌的純培養(yǎng)物還是人工污染的肉樣，本實驗建立的LAMP 方法靈敏度都可以達到普通PCR 的100 倍，從而具有較高的靈敏度。從反應時間來看，LAMP 從模板制備到結(jié)果判斷只需要2.5h 左右的時間。即使包括樣品12h 的增菌時間，LAMP 只需15h 就可以得出最終結(jié)果，而傳統(tǒng)方法對陰性樣品的確定最短也需要4d［9］。實際樣品的LAMP 檢測之前的增菌過程是十分必要的，可以減少來自樣品中死菌DNA 的影響，相應也可以提高沙門氏菌的檢出率［14］。有報道指出LAMP相比較于PCR，不易受食品基質(zhì)中成分的抑制作用，對DNA 模板純度要求不高［12］。

盡管LAMP 具有以上眾多的優(yōu)點，其自身的局限性和缺點也是無法避免的。靈敏度高和特異性強的引物對于LAMP 試驗起到至關重要的作用，LAMP 需要設計4 條甚至6 條引物，需要考慮許多復雜因素，難度較大［15］。此外，LAMP 靈敏度高的優(yōu)點也會導致易產(chǎn)生假陽性污染的缺陷，在實際操作過程中，要注意分區(qū)操作，防治污染。

總之，快速、靈敏、簡便、高效的LAMP 方法為致病菌的檢測，特別是基層實驗室快速初篩沙門氏菌，提供了一個新的思路［16］。基于LAMP 技術開發(fā)的致病菌檢測試劑盒也已成功應用于食品檢測，這表明LAMP 技術具有良好的發(fā)展前景，有望得到更為廣泛的應用［17］。

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