白首烏C21甾苷對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用

惠 勇，徐 雷

(1.牡丹江市第二人民醫院循環內二科，黑龍江牡丹江 157011;2.牡丹江市第一人民醫院泌尿外科，黑龍江牡丹江 157011)

缺血性心臟病發病率逐漸升高，心臟長期缺血導致心肌收縮功能出現障礙引起心力衰竭(CH)，是致使人體殘疾或死亡的首要病因［1］。雖然盡早恢復缺血心肌的血供，可能減少心肌不可逆的損傷，但是再灌注后可導致缺血的心肌損傷更為嚴重［2］。因此，如何有效地減輕心肌缺血再灌注(I/R)損傷儼然成為治療缺血性心臟病的最大挑戰。現代化學研究表明，白首烏中含有磷脂類、C21體酯苷、黃酮類化合物、多糖類及微量元素等多種成分，具有明顯的抗腫瘤、調節免疫和抗衰老等多種藥理作用。白首烏C21甾苷能夠清除超氧陰離子自由基和羥自由基，是白首烏中的主要活性成分［3］，但是白首烏C21甾苷對心肌I/R 損傷的影響鮮見報道。本研究旨在觀察白首烏C21甾苷對心肌I/R 損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康清潔級Wistar 系雄性大鼠40 只，體重200～250g，購于哈爾濱醫科大學動物實驗中心。實驗動物合格證號為:P00102008、實驗動物使用許可證號:SYXK (黑)2008-033。飼養于標準環境，自由飲食，12h 光照周期。實驗操作遵守中國動物實用指南。

1.2 白首烏C21甾苷的提取

白首烏粗粉用95% 乙醇回流提取，減壓回收溶劑得萃取物。萃取物稀釋后上大孔樹脂(D101)層析，水和95 %乙醇洗脫、收集95% 乙醇部分洗脫液;選擇薄層色譜法進行定性分析;選擇紫外分光光度法測定C21甾體總苷的含量［4］。經分析，C21甾苷的可測成分含量達65 %左右(按孕甾烯醇酮計)。

1.3 大鼠在體心肌缺血再灌注模型制備

手術之前禁食12h，可自由飲水，稱重后，腹腔注射100mg/kg 氯胺酮和5mg/kg 甲苯噻嗪，麻醉5～10min 后固定于實驗臺，氣管插管接呼吸機行機械通氣(呼吸頻率70 次/min，潮氣量6～7 mL/次)，分離右側頸動脈，經頸動脈行左心室置管，記錄大鼠左心功能變化，選用標準II 導聯連接心電圖，計算機軟件記錄波形。經左前胸第3、4 肋間開胸，打開心包，擠出大部分心臟，暴露心臟及左心耳，以5/0 線在距LAD 根部1～2 mm 系1 個袢，其間穿過1 根塑料管，拉緊袢，觀察心電圖變化，ST 抬高為結扎成功，結扎線以下心肌組織顏色變暗。25min 后拔出塑料管，使冠狀動脈血流再通40min，再灌時局部組織充血。再灌注成功標準:ST 段回落，心尖復紅［5-6］。

1.4 分組與處理

馴化1w 后隨機分為4 組:假手術組:大鼠麻醉后，打開胸腔，LAD 下穿線但不結扎;缺血再灌注組:手術結扎LAD 缺血25min，再灌注40 min;去勢組:大鼠手術去勢后恢復4w，然后再手術結扎LAD缺血25min，再灌注40 min;白首烏C21甾苷治療組:結扎LAD 手術前1w 胃給予白首烏C21甾苷1.0 g/ kg，連續7d，然后進行手術結扎LAD 缺血25min，再灌注40 min。對照組，缺血再關注組和去勢組分別灌胃等體積的蒸餾水。

1.5 心肌組織TNF-α 和IL-6 含量檢測

離體心臟組織冰鹽水沖洗以去除任何紅細胞或血塊，勻漿緩沖液洗滌1 次，加4 倍體積勻漿緩沖液，冰上勻漿，4℃，2 500r/min 離心20min，取上清，然后根據ELISA 試劑盒說明書對TNF-α、IL-6 進行檢測。

1.6 cTnT 的測定

實驗結束時，心臟取血約2mL，EDTA (22mg/mL)抗凝，3 000r/min 離心15min，取上清，然后根據cTnT ELISA 試劑盒說明書進行檢測。

1.7 心肌組織病理學分析

心肌組織用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片、蘇木精和伊紅染色、數字顯微鏡掃描。評分制評價組織細胞損傷程度:0 分(沒有損傷);1 分(輕度損傷)，間質水腫和局灶性壞死;2 分(中度損傷)，彌散性心肌細胞溶脹和壞死;3 分(嚴重損傷)，細胞融合性壞死并伴隨中性粒細胞浸潤;4 分(極嚴重損傷)，廣泛的細胞融合性壞死，中性粒細胞浸潤及出血［7］。

1.8 統計學方法

采用SPSS 17.0 軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 心肌組織TNF-α、IL-6 含量測定結果

與假手術組比較，缺血再灌注組心肌組織TNF-α，IL-6 含量明顯升高，差異具有統計學意義;與缺血再灌注組比較，去勢組和白首烏C21甾苷治療組心肌組織TNF-α、IL-6 含量明顯降低，差異具有統計學意義，但是去勢組和白首烏C21甾苷治療組之間沒有顯著性差異(附表)。

2.2 cTnT 含量測定結果

與假手術組比較，缺血再灌注組cTnT 含量明顯升高，差異具有統計學意義;與缺血再灌注組比較，去勢組和白首烏C21甾苷治療組cTnT 含量明顯降低，差異具有統計學意義，但是去勢組和白首烏C21甾苷治療組之間沒有顯著性差異。(附表)。

附表 心肌組織TNF-α、IL-6 含量和cTnT 含量測定結果

2.3 心肌組織病理學分析結果

假手術組(0 分):未見明顯異常，顯示心肌正常結構;缺血再灌注組(4 分):明顯的心肌損傷，可見心肌廣泛融合性病變，心肌細胞斷裂、水腫，并且有中性粒細胞浸潤;去勢組和白首烏C21甾苷治療組(1分):僅見細胞有輕度水腫，未見片狀壞，肌纖維排列較為整齊(附圖)。

附圖 小鼠心肌組織組織病理學切片(40 ×)

3 討論

在心肌缺血再灌注過程中，雖然再灌注可以改善心肌的血液供應，但也會加重心肌缺血所造成的損傷，導致血流動力學障礙、心功能異常、心肌細胞壞死和凋亡，嚴重危害患者的生命［8］，因此，對抗缺血及心肌I/R 損傷所引起的心肌梗死及功能障礙才是治療缺血性心臟病的根本目的。炎癥反應在心肌I/R 損傷中發揮了重要作用，因此，抑制炎癥反應在防治心肌I/R 損傷中具有重要意義［9］。近年來，大量研究表明，炎癥反應參與了心肌I/R 損傷的形成。冠狀動脈再通后，中性粒細胞能夠釋放IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、TNF-α、細胞間黏附分子(ICAM)等炎癥因子，這些炎癥因子相互影響、相互作用，能夠促進血管內皮細胞的通透性增加、中性粒細胞的黏附，通過血管壁等活動，進而導致心肌的損傷或心肌細胞的凋亡等［10］。TNF-α 是一種重要的炎性細胞因子，在正常的心肌組織中含量很低，但是當急性心肌I/R 后于數分鐘由巨噬細胞、單核細胞、肥大細胞大量釋放。過量的TNF-α 致心臟的損傷，同時促進IL-6 的釋放增加［11］。另外，鄒吉麗等［6］研究表明，心肌細胞產生IL-6 主要由缺血及再灌注誘導。cTnT 作為心肌細胞所特有的一種調鈣蛋白，具有高度的心肌特異性，健康人的血清中cTnT 含量很低。雖然cTnT 在血中半衰期較短，僅2h，但由于其在細胞內分布且含量豐富，并由壞死的結構蛋白不斷釋放，使其在血中異常時間可持續6d 甚至數周，其被美國和歐洲心臟協會一致評價為確診急性心肌梗死的高特異性和高敏感性的血清學標志物，其血清水平升高提示心肌細胞壞死［12-13］。

本研究結果表明，與假手術組比較，缺血再灌注組TNF-α 和IL-6 含量明顯升高，由此可見，心肌缺血再灌注加重了心肌的損傷;與缺血再灌注組比較，白首烏C21甾苷治療組可明顯降低TNF-α 和IL-6 含量;本研究還發現，缺血再灌注組cTnT 含量明顯升高，由此可見，心肌I/R 損傷可引起心肌組織的梗死。與缺血再灌注組比較，白首烏C21甾苷治療組可明顯降低cTnT 含量，縮小梗死面積。同時組織病理學也發現缺血再灌注組表現出明顯的心肌損傷，可見明顯的心肌損傷，可見心肌廣泛融合性病變，心肌細胞斷裂、水腫，并且有中性粒細胞浸潤，白首烏C21甾苷治療組僅顯示輕度損傷。

綜上所述，白首烏C21甾苷可顯著抑制心肌炎癥因子，減輕心肌組織形態損傷，縮小梗死面積，改善受損的心肌功能，從而起到保護心肌的作用，具體作用機制有待于進一步研究。睪酮在心肌損傷過程中的作用可能是非常重要的，如睪酮對心肌細胞的損傷主要是通過促炎因子的釋放增加可促進心臟功能障礙和重構［14-15］。本研究所設置的去勢組的結果與白首烏C21甾苷治療組結果相同，所以白首烏C21甾苷是否拮抗雄激素的作用也是本研究進一步研究的目標。

［1］李顯麗.曲美他嗪治療缺血性心臟病并心力衰竭療效分析［J］.中國當代醫藥，2011，18(7):69-70.

［2］王慶高，盧健棋，李成林，等.扶芳藤丹參合劑預處理對AS 大鼠心肌缺血再灌注損傷中TNF-α 及NF-κB 的影響［J］.廣西中醫藥大學學報，2013，16(2):9-11.

［3］陳美華，等.白首烏對實驗性小鼠抗氧化及耐缺氧作用的研究［J］.中國食物與營養，2010，1:71-73.

［4］陸佳靜，等.白首烏C21 甾苷對小鼠腦缺血再灌注致學習記憶損傷的保護作用［J］.中成藥，2009，31(3):463-465.

［5］王加佳，夏中元，趙博，等.DJ-1/PTEN 通路在糖尿病大鼠心肌缺血/ 再灌注期間對心肌損傷的影響［J］.中國現代醫學雜志，2013，23:37-40.

［6］鄒吉麗，尹照萍，張利群，等.大鼠心肌缺血再灌注早期心肌及血清中IL-6、TNF-α 的表達［J］.中國醫科大學學報，2013，42(9):830-833.

［7］樊鑫梅，等.香青蘭總黃酮對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護作用的研究［J］.中成藥，2013，35(8):1625-1629.

［8］白國良，周建斌，劉保江.舒芬太尼對大鼠心肌缺血再灌注中Toll 樣受體4 以及腫瘤壞死因子α 的影響［J］.當代醫學，2013，19(17):18-20.

［9］王慶高，盧健棋，李成林，等.扶芳藤丹參合劑預處理對AS 大鼠心肌缺血再灌注損傷中TNF-α 及NF-κB 的影響［J］.廣西中醫藥大學學報，2013，16(2):9-11.

［10］劉靈芝.巴戟天醇提物對離體大鼠心肌缺血再灌注損傷后白介素-1β、腫瘤壞死因子-α 及心肌細胞凋亡的影響［J］.中國醫藥導報，2012，9(29):11-15.

［11］王怡，王少峽，任明，等.首烏丹參方預處理對IR 大鼠心肌梗死范圍及血中TNF-α、IL-1β 的影響［J］.四川中醫，2007，25(1):7-9.

［12］陳小君，孟淑娟，楊凱.cTnT、CK－ MB、FIB 和DD聯合檢測在急性心肌梗死中的診斷價值［J］.國際檢驗醫學雜志，2012，33(12):1440-1441.

［13］郭慧佳，張建義，胡亞軍，等.高敏肌鈣蛋白T 與慢性心力衰竭的相關性及對急性心肌梗死的鑒別意義［J］.中國全科醫學，2014，17(8):871-874.

［14］劉巍，李為民，Sally A.Huber.性激素對心臟重構的影響［J］.中國實 用內科雜志，2010，30 (11):1035-1037.

［15］M.Wang，B.M.Tsai，A.Kher，L.B.Baker，et al.Role of endogenous testosterone in myocardial proinflammatory and proapoptotic signaling afteracute ischemia-reperfusion ［J］.American Journal of Physiology，2005，288(1):221-226.