胰島素注射液質量現狀及相關標準研究

丁曉麗，李湛軍，辛中帥，張 慧，梁成罡（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

1921年，Banting和Best首次成功提取胰島素，使糖尿病的治療成為可能；1923年，胰島素開始應用于臨床[1]。從來源上，胰島素制劑可分為動物胰島素、人胰島素和胰島素類似物[2]。胰島素注射液是從動物（豬、牛或羊）胰臟中提取的[3]，屬動物胰島素，而由于動物胰島素氨基酸序列與人胰島素的差異[4]以及生產工藝本身的缺陷[5]，其對人體來說是異種蛋白，長期使用會引起不同程度的免疫反應[6]，易出現過敏反應和注射部位皮下脂肪萎縮等[7]。2013 年，艾美仕市場研究公司（IMS Health）市場調研數據顯示，中國仍有10.2%的動物胰島素使用量，其中中小城市占比高于大城市[8]。筆者曾委托國家藥品不良反應監測中心對胰島素制劑2009年的臨床不良反應進行了檢索。報告顯示，當年胰島素制劑臨床不良反應病例共339例，其中動物胰島素報告250 例，人胰島素報告89 例，而動物胰島素中胰島素注射液報告213例，占總數的62.8%。這一數據說明，胰島素注射液的不良反應發生率遠高于其他胰島素制劑，應引起重視。

胰島素注射液的原料主要是豬胰島素，該品種pH 呈酸性，因此又稱酸性胰島素注射液。該藥于2009 年列入我國基本藥物目錄[9]，屬醫保甲類藥物。《中國藥典》自2000年版開始已不再收載此品種，但截止2010年，市場上仍在廣泛流通和使用，生產企業22家，批準文號27個。

本研究以市場抽驗的32 批胰島素注射液為對象，按照本品法定檢驗標準進行了全檢，并參照同類產品的法定檢驗標準，對有關物質、含量、苯酚、高分子蛋白質及鋅等關鍵質控項目進行了分析，以為了解胰島素注射液的質量現狀及提高相關檢驗標準提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AD 型高效液相色譜（HPLC）儀，包括20AD 泵、SPD-20A紫外可見檢測器、LC-Solution色譜工作站（日本島津公司）；AA6800 原子吸收分光光度計（日本島津公司）；XS205DU電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 對照品

豬胰島素對照品（批號：140720-200901，規格：15 mg/支，純度：90.85%）、胰島素單體-二聚體對照品（批號：140634-201303，規格：約4 mg/瓶，用于系統適用性試驗）均購自中國食品藥品檢定研究院；苯酚對照品（批號：141436340309273，純度≥99.5%）購自美國Sigma 公司；鋅單元素標準溶液（批號：GB08620，規格：1 000μg/ml）購自中國計量科學院。

1.3 藥品與試劑

胰島素注射液（規格：10 ml∶400 U，原料均為豬胰島素）樣品共32批，分別抽自18個省，涉及3個生產企業和3個批準文號；中性胰島素注射液（規格：10 ml∶400 U，原料均為豬胰島素），樣品共8 批。乙腈為色譜純，購于美國Fisher 公司；磷酸、無水硫酸鈉、醋酸、精氨酸、乙醇胺、鹽酸均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司；水為Millipore 超純水機制備的去離子水。

2 方法

2.1 法定檢驗標準

胰島素注射液的法定檢驗標準為1995 年版《中國藥典》（二部），具體項目見表1。

表1 胰島素注射液法定檢驗標準Tab 1 Statutory specification of Insulin injection

2.2 關鍵質控項目

參照2010年版《中國藥典》（二部）重組人胰島素注射液及中性胰島素注射液的法定檢驗標準[10]，對胰島素注射液分別進行有關物質、含量、苯酚、高分子蛋白質、鋅等關鍵質控項目的考察。

2.2.1 有關物質 采用RP-HPLC 法進行測定。色譜柱為Grace Vydac C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，300 ?）；流動相A 為0.2 mol/L硫酸鹽緩沖液（取無水硫酸鈉28.4 g，加水溶解后，加磷酸2.7 ml、水800 ml，用乙醇胺調節pH 至2.3，加水至1 000 ml）-乙腈（82∶18，V/V），流動相B 為乙腈-水（50∶50，V/V），采用梯度洗脫（0～36 min，22%→22%B；36～61 min，22%→67%B；61～67 min，67%→67%B，調節流動相B的比例，使重組人胰島素主峰的保留時間約為25 min）；檢測波長為214 nm；流速為1.0 ml/min；柱溫為40 ℃；進樣量為20 μl。以胰島素注射液作為供試品溶液。采用面積歸一化法，計算A21脫氨胰島素及其他有關物質的含量。

2.2.2 含量測定 采用RP-HPLC 法進行測定。色譜柱為Grace Vydac C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，300 ?）；流動相為0.2 mol/L硫酸鹽緩沖液（pH 2.3）-乙腈（74∶26或適宜比例，V/V）；檢測波長為214 nm；流速為1 ml/min；柱溫為40 ℃；進樣量為20 μl。精密稱取豬胰島素對照品適量，加0.01 mol/L鹽酸溶液溶解并制成質量濃度約為0.35 mg/ml 的溶液，作為對照品溶液；精密量取胰島素注射液2.5 ml，加0.01 mol/L 鹽酸稀釋至10 ml，作為供試品溶液。采用外標法，以胰島素主峰峰面積與A21脫氨胰島素峰面積之和計算含量。

2.2.3 高分子蛋白質 采用高效液相分子排阻色譜（HPSEC）法進行測定。色譜柱為Waters Insulin HMWP（300 mm×7.8 mm，10 μm，125 ?）；流動相為冰醋酸-乙腈-0.1%精氨酸溶液（15∶20∶65，V/V/V）；檢測波長為276 nm；流速為0.5 ml/min；進樣量為100 μl。以胰島素注射液作為供試品溶液。采用面積歸一化法，計算高分子蛋白質的含量。

2.2.4 苯酚 采用RP-HPLC法進行測定。色譜條件同“2.2.2”項，但檢測波長為270 nm。精密稱取苯酚對照品適量，加0.01 mol/L鹽酸溶液溶解并制成質量濃度約為0.25 mg/ml的溶液，作為對照品溶液；精密量取胰島素注射液1 ml，加0.01 mol/L鹽酸稀釋至10 ml，作為供試品溶液。采用外標法，計算苯酚的含量。

2.2.5 鋅 精密量取鋅單元素標準溶液適量，用0.01 mol/L鹽酸溶液分別稀釋成鋅質量濃度為0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 μg/ml的系列標準溶液。精密量取胰島素注射液1 ml，加0.01 mol/L 鹽酸稀釋至25 ml，作為供試品溶液。按照2010 年版《中國藥典》（二部）附錄ⅣD 第一法原子吸收分光光度法[10]測定，并計算鋅的含量。

3 結果與討論

3.1 法定檢驗

32 批樣品檢驗結果均符合規定。其中，生物法測定胰島素效價的結果分布在91%～116%，詳見圖1。

3.2 有關物質

胰島素注射液的有關物質色譜見圖2。結果表明，32批樣品中雜質A21脫氨胰島素含量分布在15.6%～39.2%，超出同類產品規定的5.0%的限度標準，詳見圖3。其他有關物質含量分布在0.4%～0.6%，低于同類產品規定的6.0%的限度標準。

圖1 胰島素注射液效價測定結果Fig 1 Titer determination results of Insulin injection

圖2 胰島素注射液有關物質色譜圖1.防腐劑；2.胰島素；3.A21脫氨胰島素Fig 2 Chromatograms of related impurities in Insulin injection1.preservative；2.insulin；3.A21desamido insulin

圖3 胰島素注射液中A21脫氨胰島素測定結果Fig 3 Determination results of A21desamido insulin in Insulin injections

A21脫氨胰島素是胰島素注射液常見的雜質，A21脫氨胰島素含量過高會影響胰島素的療效及穩定性[11]。現行各國藥典胰島素原料及相關制劑品種項下，均對A21脫氨胰島素及其他有關物質有嚴格的限度規定[12]：“A21脫氨胰島素不得過5.0%，其他有關物質總和不得過6.0%。”本研究結果顯示，胰島素注射液中A21脫氨胰島素含量普遍偏高。分析發現，這是由胰島素注射液的生產工藝及處方導致的。胰島素注射液是一個比較老的品種，由于早期純化工藝的局限性，胰島素注射液中含有一定量的蛋白水解酶，而酸性環境可以抑制蛋白水解酶對胰島素的降解[13]，因此胰島素的處方是酸性的，pH 保持在2.5～3.5。但是胰島素在酸性條件下不穩定，易引起A21位門冬酰胺的脫氨基反應，形成A21脫氨胰島素，導致A21脫氨胰島素含量較高，使胰島素注射液的穩定性降低，貨架期質量不可控。

目前，動物胰島素的生產工藝經歷了從粗提胰島素、結晶胰島素到高純胰島素的進步[8]，隨著胰島素純化工藝的提高，蛋白水解酶的含量已經大大降低，蛋白水解酶對胰島素的降解已變成次要因素，胰島素注射液的處方也無須再保持酸性環境，于是研制出了中性胰島素注射液。本研究同時抽取了8批中性胰島素注射液并對其進行有關物質檢查，樣品中A21脫氨胰島素的含量均小于0.1%。與胰島素注射液相比，中性胰島素注射液的A21脫氨胰島素含量較低，穩定性較好，詳見圖4。

3.3 含量測定

RP-HPLC 測定方法中，胰島素的含量是以胰島素主峰峰面積與A21脫氨胰島素峰面積之和進行計算，因此含量過高的A21脫氨胰島素沒有對胰島素注射液的含量測定結果產生影響，32批樣品含量測定結果為93.2%～102.7%，符合同類產品規定的90.0%～110.0%限度標準，詳見圖5。

圖4 胰島素注射液與中性胰島素注射液有關物質色譜圖A.胰島素注射液；B.中性胰島素注射液；1.防腐劑；2.胰島素；3.A21脫氨胰島素Fig 4 Chromatograms of related impurities in Insulin injection and Neutral insulin injectionA.Insulin injection；B.Neutral insulin injection；1.preservative；2.insulin；3.A21desamido insulin

圖5 胰島素注射液含量測定結果Fig 5 Contents determination results of Insulin injection

然而，RP-HPLC法含量測定結果也顯示，胰島素主峰已降解為59.9%～83.8%，但由于A21脫氨胰島素具有與胰島素相似的生物活性，生物法測定胰島素效價的結果仍為91%～116%。說明胰島素注射液的法定標準中僅僅采用生物法測定胰島素效價，胰島素主峰大量降解的現象會被掩蓋。目前，各國現行藥典及我國進口注冊標準對胰島素原料及制劑均采用RP-HPLC 法進行含量測定，該方法能更加及時并準確地反映出胰島素注射液的穩定性變化情況，適用于胰島素注射液產品的放行標準及對其有關物質及主峰含量進行監控。

3.4 其他

胰島素注射液中高分子蛋白質的測定結果分布在0.5%～0.6%，符合同類產品標準規定的不得過2.0%的限度，詳見圖6；苯酚測定結果在2.34～2.51 mg/ml，符合同類產品標準規定的2.00～2.75 mg/ml 的限度，詳見圖7；鋅測定結果分布在12.3～14.8μg/100 U，符合同類產品標準規定的10～40μg/100 U的限度，詳見圖8。胰島素分子具有復雜的自聚合特性[14]，易形成二聚體及多聚體等高分子蛋白質，有可能引起過敏反應。胰島素注射液是通過2個鋅離子（Zn2+）把6個分子聚集在一起形成六聚體結晶體，Zn2+和苯酚能夠顯著增強六聚體的穩定性[15]，因此，高分子蛋白質、苯酚及鋅含量的控制與胰島素的藥效作用密切相關，應對其進行監控。本研究結果顯示，各廠家產品在高分子蛋白質、苯酚及鋅含量等方面整體上控制較好。

4 結論

4.1 質量標準

胰島素注射液自2000 年版《中國藥典》開始就不再收載，其法定檢驗標準一直執行1995年版《中國藥典》。該法定檢驗標準缺少有關物質、含量測定、苯酚、高分子蛋白質、鋅含量測定等多個關鍵質控項目，無法對產品質量實現有效控制。

圖6 胰島素注射液中高分子蛋白質測定結果Fig 6 Determination results of protein polymer in Insulin injection

圖7 胰島素注射液中苯酚測定結果Fig 7 Determination results of phenol in Insulin injection

圖8 胰島素注射液中鋅含量測定結果Fig 8 Content determination results of Zn in Insulin injection

4.2 產品質量現狀

抽驗的各批胰島素注射液中，A21脫氨胰島素含量普遍較高，盡管其具有與胰島素相似的生物活性，但胰島素的不斷降解致使產品穩定性降低，貨架期質量不可控，存在潛在的安全隱患，故不容輕視。

4.3 標準提高

本研究結果上報了國家食品藥品監督管理總局，鑒于胰島素注射液的質量標準及產品質量狀況，總局發布實施了國家藥品標準修訂件（XGB2011-094），對1995 年版《中國藥典》（二部）胰島素注射液及2010年版《中國藥典》（二部）中性胰島素注射液兩品種合并，執行標準均為2010年版《中國藥典》（二部）中性胰島素注射液質量標準，為公眾用藥的安全性及有效性提供了保障。

4.4 思考

在胰島素制劑缺乏的年代，胰島素注射液對于滿足患者尤其是低收入群體患者的用藥可及性起到了重要的歷史作用。但目前，隨著基因工程技術的發展，重組人胰島素將逐步取代動物胰島素，同時胰島素制劑及胰島素類似物也在不斷開發與研制[18]，各種胰島素產品相繼問世，為不同群體的糖尿病患者提供了更多的選擇空間。2013年《中國2型糖尿病防治指南（基層版）》建議：在胰島素種類的選擇上推薦使用人胰島素，盡量不用動物胰島素[17]。但對于經濟狀況確實比較困難、醫療保障及醫療條件較差的群體，建議考慮使用穩定性相對較好且安全系數相對較高的動物胰島素品種。

[1]Roth J，Qureshi S，Whitford I，et al.Insulin’s discovery：new insights on its ninetieth birthday[J].Diabetes Metab Res Rev，2012，28（4）：293.

[2]田雅晨，陳在余，馬愛霞.我國胰島素市場狀況淺析[J].北方藥學，2013，10（5）：110.

[3]饒建華，陳廷勝，禹騰波.糖尿病治療藥物-胰島素研究進展[J].中國實用醫藥，2009，4（29）：220.

[4]龐媛尹.人胰島素和動物胰島素治療糖尿病的對比觀察[J].廣西醫科大學學報，2000，17（4）：676.

[5]Akram M，Naqvi SB，Khan A.Design and development of insulin emulgel formulation for transdermal drug delivery and its evaluation [J].Pak J Pharm Sci，2013，26（2）：323.

[6]孔毅，喬德水.重組人胰島素生產工藝監控方法研究進展[J].藥物生物技術，2003，10（2）：121.

[7]李媛紅，賈樹爾，馬曉萍.胰島素泵小劑量胰島素脫敏治療的效果分析[J].吉林醫學，2015，36（3）：417.

[8]母義明，趙家軍，朱大龍，等.人胰島素和動物胰島素的臨床使用專家意見[J].藥品評價，2014，11（15）：8.

[9]衛生部.國家基本藥物目錄[M].2012 年版.北京：中國法制出版社，2013：31.

[10]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：24、569、846、附錄ⅣD.

[11]張瑩.重組人胰島素中的脫酰胺胰島素的檢驗[J].天津藥學，2001，13（5）：14.

[12]Robbins DC，Andersen L，Bowsher R，et al.Report of the American diabetes association’s task force on standardization of the insulin assay[J].Diabetes，1996，45（2）：242.

[13]喬德水，毛璞.胰島素注射液的穩定性考察[J].中國生化藥物雜志，1993（2）：20.

[14]辛中帥，苑方圓，呂萍，等.地特胰島素高分子蛋白質定性和定量分析[J].藥物分析雜志，2014，34（6）：1 033.

[15]李代禧，劉寶林，郭柏松，等.胰島素聚合反應過程的分子模擬研究[J].生物醫學工程學雜志，2013，30（5）：934.

[16]李俊德，劉少華，唐蜜.臨床研究中的胰島素類藥物進展[J].煤炭與化工，2014，12（37）：28.

[17]中華醫學會糖尿病學分會.中國2型糖尿病防治指南：基層版[J].中華全科醫師雜志，2013，12（8）：675.