丹珍頭痛膠囊的HPLC指紋圖譜研究

張宇霞，昝占全，王統霞，李春梅，紀蘭菊#（.青海益欣藥業有限責任公司，西寧 80003；2.中國科學院西北高原生物研究所/中國科學院藏藥研究重點實驗室，西寧 8000；3.中國科學院大學生命科學學院，北京 00049）

丹珍頭痛膠囊是青海益欣藥業有限責任公司原研獨家產品，由高原丹參、夏枯草、熟地黃、珍珠母、雞血藤、川穹、當歸、白芍、菊花、蒺藜、鉤藤、細辛共十二味中、藏藥材組成，具有平肝熄風、散瘀通絡、解痙止痛的功效，可用于肝陽上亢、瘀血阻絡所致的頭痛、背痛頸酸、煩躁易怒等癥，特別是針對腦供血不足、高血壓腦外傷后遺癥、偏頭痛、神經衰弱、頸椎病等引起的多發性、慢性頭痛具有療效顯著、標本兼治的綜合效果，在臨床上用于治療偏頭痛[1]、血管神經性頭痛[2]。

患者用藥的安全性與藥品生產工藝的穩定性、質量標準的完善和提高密切相關。目前，丹珍頭痛膠囊標準中可監控的藥材僅有高原丹參[薄層色譜（TLC）鑒別丹參酮ⅡA]和白芍[TLC鑒別芍藥苷、含量測定芍藥苷）兩味藥材。筆者曾對該藥品中其他藥材的主要成分進行了TLC鑒別及高效液相色譜（HPLC）法測定含量，以期完善其質量標準，但都受到了不同程度陰性干擾。化學指紋圖譜可用于全面評價藥材或者藥品的質量，如紅外指紋圖譜[3]、氣相色譜-質譜（GC-MS）指紋圖譜[4]、HPLC 指紋圖譜[5]、TLC 指紋圖譜[6]等。由于該藥品中含中藥材種類較多，化學成分復雜，考慮到指紋圖譜可以全面反映樣品中的化學信息，同時近年來HPLC指紋圖譜用于藥品質量評價也較多[7-10]，在本研究中筆者對丹珍頭痛膠囊進行了HPLC指紋圖譜研究并對其進行相似度評價，以為完善丹珍頭痛膠囊的質量控制方法提供參考。

1 材料

515型HPLC儀，包括溶劑管理系統、二極管陣列檢測器、Empower 色譜工作站（美國Waters 公司）；KQ-100B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ESJ182-4型電子天平（沈陽龍騰電子有限公司）；HH-4型數顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）。

丹珍頭痛膠囊（批號：20131105、20131203、20131204、20140602、20140603、20140607、20140608、20140609、20140 601、20140602，編號為S1～S10）由青海益欣藥業有限責任公司提供；阿魏酸、芍藥苷、綠原酸、木犀草苷、3，5-O-雙咖啡酰基奎寧酸、丹酚酸B、丹參酮ⅡA、迷迭香酸對照品的質量濃度分別為0.012 0、0.029 4、0.030 9、0.040 9、0.030 5、0.136 0、0.016 0、0.312 0 mg/ml（批號分別為MUST-13090901、MUST-11090902、MUST-11090911、MUST-12090901、MUST-14090901、MUST-14090908、MUST-15090906、MUST-16090903）均購自成都曼思特生物科技有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，磷酸為分析純，水為純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Dikma Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為水，流動相B為甲醇-乙腈（1∶1，V/V），梯度洗脫（0～10 min，15%→25%B；10～20 min，25%→40%B；20～60 min，40%→90%B；60～65 min，15%B）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：340 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μl；記錄時間：65 min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 取阿魏酸、芍藥苷、綠原酸、木犀草苷、3，5-O-雙咖啡酰基奎寧酸、丹酚酸B、丹參酮ⅡA、迷迭香酸對照品各適量，加入甲醇制成每1 ml 含0.012 0 mg 阿魏酸、0.029 4 mg 芍藥苷、0.030 9 mg 綠原酸、0.040 9 mg 木犀草苷、0.030 5 mg、3，5-O-雙咖啡酰基奎寧酸、0.136 0 mg 丹酚酸B、0.016 0 mg 丹參酮ⅡA和0.312 0 mg 迷迭香酸的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 將丹珍頭痛膠囊粉末過七號篩，精密稱取約1.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，稱定質量，回流提取2 h，放冷，用甲醇補足缺失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，經0.45 μm微孔濾膜濾過，得供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6 次，記錄峰面積。結果，相似度均為0.90以上。以第11號峰為對照峰S，測定6次色譜中各共有峰的相對保留時間及相對峰面積比值的一致性。結果，RSD分別為0.09%（阿魏酸）、0.10%（芍藥苷）、0.20%（綠原酸）、0.15%（木犀草苷）、0.12%（3，5-O-雙咖啡酰基奎寧酸）、0.09%（丹酚酸B）、0.12%（丹參酮ⅡA）、0.20%（迷迭香酸），說明儀器精密度良好，符合指紋圖譜技術要求。

2.3.2 穩定性試驗 取同一樣品（編號：S8）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于放置2、4、6、8、10 h 時按“2.1”項下色譜條件連續進樣6 次，記錄峰面積。結果，相似度均為0.90以上。以第11號峰為對照峰S，測定6次色譜中各共有峰的相對保留時間及相對峰面積比值的一致性。結果，RSD 分別為0.15%（阿魏酸）、0.16%（芍藥苷）、0.20%（綠原酸）、0.15%（木犀草苷）、0.21%（3，5-O-雙咖啡酰基奎寧酸）、0.19%（丹酚酸B）、0.11%（丹參酮ⅡA）、0.22%（迷迭香酸），說明供試品溶液在10 h內基本穩定。

2.3.3 重復性試驗 取同一樣品（編號：S8）適量，共6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件連續進樣6 次，記錄峰面積。結果，相似度均為0.90 以上。以第11號峰為對照峰S，測定6次色譜中各共有峰的相對保留時間及相對峰面積比值的一致性。結果，RSD分別為0.15%（阿魏酸）、0.17%（芍藥苷）、0.20%（綠原酸）、0.14%（木犀草苷）、0.20%（3，5-O-雙咖啡酰基奎寧酸）、0.19%（丹酚酸B）、0.12%（丹參酮ⅡA）、0.23%（迷迭香酸），說明本方法重復性良好，符合指紋圖譜技術要求。

2.4 樣品指紋圖譜的建立及相似度評價

取10批樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，將所得的HPLC 圖譜導入國家藥典委員會《中藥指紋圖譜相似度評價系統（2004A）》軟件，選擇批號20131203的藥品為參照圖譜，以平均數法生成對照指紋圖譜，時間窗寬度為0.10 min，對比色譜圖，確定共有峰為13個，詳見圖1。以色譜峰穩定、重復性較好的第11號峰為對照峰S，各共有峰相對保留時間比值的RSD為0～0.27%，說明10 批樣品中13 個共有峰都能穩定出現。而相對峰面積比值的RSD最高卻達到60%以上，說明各批樣品中13個共有峰的含量相差較大，故需提高對該藥品的質量控制。對10 批丹珍頭痛膠囊進行相似度評價，相似度均大于0.90，詳見表1。

圖1 10批丹珍頭痛膠囊高效液相色譜指紋圖譜Fig 1 HPLC fingerprint chromatogram of 10 batches of Danzhen headache capsules

表1 10批丹珍頭痛膠囊的相似度計算結果Tab 1 Results of similarity of 10 batches of Danzhen headache capsules

3 討論

3.1 提取方法的選擇

分別對提取溶劑（甲醇、乙酸乙酯、甲醇-乙酸乙酯、無水乙醇）、提取時間（0.5、1、1.5、2、2.5 h）、提取方法（回流、超聲）、料液比（1∶16、1∶20、1∶50、1∶100）、樣品粒度（過四號篩、過七號篩）進行考察，發現以甲醇回流、提取時間2 h、提取料液比1∶16、樣品粒度為過七號篩時，峰的數量、分離度及峰形均較好。

3.2 色譜條件的優化

在樣品指紋圖譜條件摸索過程中，分別以甲醇（乙腈）-水、甲醇（乙腈）-0.01%磷酸緩沖液、甲醇-乙腈-水、甲醇-乙腈-0.01%磷酸緩沖液為流動相，且試用不同的梯度，最后確定選擇流動相A為水、流動相B為甲醇-乙腈（1∶1，V/V）、梯度洗脫時，各峰分離度較好。

3.3 檢測波長的選擇

采用二極管陣列檢測器對樣品進行200～400 nm 全波長掃描，發現340 nm 波長處檢測到的峰數目較多，且分離度較好，故確定340 nm為檢測波長。

3.4 指紋圖譜數據分析

10批丹珍頭痛膠囊中13個共有峰的相對保留時間和相對峰面積計算結果顯示，各共有峰出峰時間基本穩定，但共有峰對應的化合物含量差異較大，可能與藥材的產地、采收期、采收年限、貯藏及生產工藝控制等因素有關。故需重視藥材來源，選用優質藥材，嚴格控制生產工藝，保證藥品的質量。

綜上所述，該方法簡便、準確、重復性好，可用于丹珍頭痛膠囊的工藝穩定性評價和質量控制。

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