HPLC法同時測定心神寧片中梔子苷和甘草苷的含量

宋 佳，段樹卿，李云霞#（1.承德醫(yī)學(xué)院研究生院，河北承德 067000；.頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北承德 067000）

心神寧片由酸棗仁、遠(yuǎn)志、茯苓、梔子、神曲、甘草等六味中藥組成，收載于國家藥品標(biāo)準(zhǔn)[WS-10410（ZD-0410）2002-2012Z]，具有養(yǎng)血除煩、寧心安神的功效，可用于心肝血虛、失眠多夢、煩躁而驚、疲倦食少等癥。現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)中含量測定項(xiàng)下只測定了梔子苷含量一項(xiàng)[1]。目前，國內(nèi)外有對心神寧片中酸棗仁皂苷A、B 及梔子苷含量測定的相關(guān)報道[1-3]，但未見心神寧片中測定甘草苷含量的報道。為此，筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[4-8]，采用高效液相色譜（HPLC）法同時測定了心神寧片中梔子苷、甘草苷的含量，以為心神寧片的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

Agilent 1100 HPLC 儀，包括G1322A 型真空脫氣機(jī)、Agilent 1100 型泵、G1313A 型自動進(jìn)樣器、紫外檢測器、Chem-Station 色譜工作站（美國Agilent 公司）；KQ-500DE 型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：500 W，頻率：40 kHz）；AE 240 型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

心神寧片（頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號：392170、492009、492016、492043、492241、492242、492247；某藥廠市售，批號：140519、140802、140804，規(guī)格均為0.25 g/片）；梔子苷對照品（批號：110749-201316，純度：97.5%）、甘草苷對照品（批號：11610-201106，純度：93.7%）均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈（美國Fisher公司）為色譜純；乙醇（天津佳興化工玻璃儀器工貿(mào)有限公司）為分析純，水為三級反滲法制得的純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～10 min，12%A→19%A；10～18 min，19%A～30%A；18～21 min，30%A→12%A）；流速：1.0 ml/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：238 nm；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取梔子苷、甘草苷對照品適量，加入70%乙醇，制成每1 ml含梔子苷0.08 mg、甘草苷0.04 mg的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取心神寧片數(shù)片，除去包衣，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 ml，稱定質(zhì)量，超聲處理45 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，續(xù)濾液經(jīng)0.45μm的微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按處方中的藥味比例，分別配制不含梔子和甘草的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對照溶液，即得。

2.3 專屬性試驗(yàn)

精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜。結(jié)果，在該色譜條件下，陰性樣品對測定無干擾。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.缺甘草的陰性樣品；B.缺梔子的陰性樣品；C.供試品；D.混合對照品；1.梔子苷；2.甘草苷Fig 1 HPlC chromatogramsA.negative samples without Glycyrrhiza uralensis；B.negative samples without Gardenia jasminoides；C.test sample；D.mixed reference；1.geniposide；2.liquiritin

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取梔子苷、甘草苷對照品各適量，加入70%乙醇分別制成每1 ml含梔子苷0.815 9 mg、甘草苷0.371 8 mg的對照品母液；分別精密量取上述對照品母液25 ml，置于同一50 ml量瓶中，制成每1 ml 含梔子苷、甘草苷0.185 9 mg 的混合對照品貯備液。分別精密吸取對照品貯備液1、2、4、5、6、8、25 ml，置于25 ml 量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得梔子苷、甘草苷回歸方程分別為y＝11 663x+11.482（r＝0.999 9）、y＝19 034x+16.519（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，梔子苷、甘草苷質(zhì)量濃度在16.3～407.9、7.4～185.9 μg/ml范圍內(nèi)與各自峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 定量限與檢測限

以信噪比為10 計算梔子苷、甘草苷的最低定量限分別為5.439、2.478 6 ng；以信噪比為3 計算梔子苷、甘草苷的最低檢測限分別為1.813、0.826 2 ng。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下梔子苷和甘草苷質(zhì)量濃度分別為0.081 6、0.037 2 mg/ml的混合對照品溶液10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，梔子苷、甘草苷峰面積的RSD分別為0.67%、0.78%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號：492009）10 μl，分別于放置0、2、4、6、8、10、12 h時按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，梔子苷、甘草苷峰面積的RSD 分別為0.80%、1.63%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取心神寧片（批號：492009）粉末適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，梔子苷、甘草苷的平均含量分別為8.725 8、3.404 9 mg/g，RSD分別為1.46%、0.74%（n＝6），表明本方法重復(fù)性較好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品（批號：492009）約0.25 g，共9份，分別加入一定量的混合對照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Result of recovery test（n＝9）

2.10 樣品含量測定

取10 批心神寧片適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，按外標(biāo)法計算樣品含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝9，mg/g）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝9，mg/g）

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

筆者以二級陣列檢測器對梔子苷、甘草苷進(jìn)行全波長波長（200～400 nm）掃描，結(jié)合3D圖譜，發(fā)現(xiàn)二者在238 nm波長處均有較大吸收，故選用238 nm為檢測波長；又考察了兩種色譜柱CAPCELL PAKMG C18、Inertsil ODS-3，其中Inertsil ODS-3分離效果較好，且分離時間適中，因此選用Inertsil OD-3進(jìn)行色譜分離。

3.2 提取方法的選擇

筆者比較了3 種提取方法（索氏提取除雜再進(jìn)行超聲、先超聲再進(jìn)行萃取除雜、直接超聲），結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種方法均對被測成分無干擾且可較好地分離，考慮到操作的簡便性，故選用直接超聲法。此外，還考察了不同溶劑（甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇）對結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用70%乙醇與甲醇作為提取溶劑時，梔子苷含量基本一致，均能較好地提取分離梔子苷與甘草苷，考慮到乙醇的毒性小，故選用70%乙醇為提取溶劑。又考察了超聲時間（30、45、60、90 min）對結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲45 min 即可提取完全。

綜上所述，本方法準(zhǔn)確、靈敏、簡便，可用于心神寧片中梔子苷和甘草苷的含量測定。

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