HPLC法測定牛磺熊去氧膽酸膠囊含量的臨床分析

劉小雙 蒲旭峰 歐世榮 楊蕊

HPLC法測定牛磺熊去氧膽酸膠囊含量的臨床分析

劉小雙 蒲旭峰 歐世榮 楊蕊

目的建立測定牛磺熊去氧膽酸膠囊含量的方法。方法采用KromasilC18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm), 流動相為乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液(80%磷酸調pH至3.5), 梯度洗脫, 檢測波長205 nm, 柱溫30℃, 流速1.2 ml/min, 進樣量20 μl。結果牛磺熊去氧膽酸在0.0953～1.9050 mg/ml范圍內與濃度呈良好的線性關系(r=0.9999)；加樣回收率為99.93%, RSD=1.0%(n=9)。結論采用高效液相色譜法(HPLC)測定牛磺熊去氧膽酸膠囊含量, 該方法簡便準確、精密度和重復性良好, 結果準確可靠。

牛磺熊去氧膽酸膠囊含量；高效液相色譜法

牛磺熊去氧膽酸是熊膽汁的有效成分, 而且僅在熊膽汁酸中含有, 其化學名是2-｛[(3,5,7)-3α,7β-二羥基-24-氧代膽甾烷-24-基]氨基｝乙烷磺酸, 二水合物[1], 分子式為C26H45NO6S·2H2O, 分子量為535.74, 是目前發現的人體內親水性最強的膽汁酸, 是熊去氧膽酸在膽汁中的生理活性形式。牛磺熊去氧膽酸具有溶解膽固醇結石和保護肝細胞等多項生理功能。牛磺熊去氧膽酸膠囊由BruschettiniS.r.I.(意大利貝司迪大藥廠)研制,2006年以商品名滔羅特獲準在中國銷售, 最新注冊證號為H20110233, 規格為250 mg×20粒/盒。臨床主要用于治療膽囊膽固醇結石、原發硬化性膽管炎、原發膽汁性肝硬化和慢性丙型病毒性肝炎等[2-4]。牛磺熊去氧膽酸膠囊在國內外的藥典中尚未見收載, 現采用HPLC測定牛磺熊去氧膽酸膠囊的含量, 操作方便, 專屬性好, 結果準確, 重現性良好, 現報告如下。

1 材料來源

1.1 儀器 Agilent1200高效液相色譜儀 [Agilent1200G1311A四元泵, Agilent1200MWDG1365D檢測器, Agilentchemstation化學色譜工作站(B.04.02)]；電子分析天平：METTLERT OLEDOXS105(0.1/0.01 mg)；KQ3200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；UV-1601型紫外分光光度計(日本島津)；pHS-3C數字酸度計(上海精科儀器有限公司)。

1.2 試藥 牛磺熊去氧膽酸鈉對照品(購自美國TRC公司,批號：T009200), 甲醇、乙腈均為色譜純(Sigma公司), 水為超純水；其他試劑試藥均為分析純；市售滔羅特牛磺熊去氧膽酸膠囊(批號：0907、1165, 均由成都欣捷高新技術開發有限公司提供)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 流動相為乙腈(A)-0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液(80%磷酸調pH至3.5), 梯度洗脫(0 min,20%A；8 min,45%A；30 min,20%A)；柱溫：30℃；檢測波長：205 nm, 流速1.2 ml/min, 進樣量20 μl。在上述色譜條件下, 理論板數按牛磺熊去氧膽酸計算不得低于6000, 拖尾因子不得過2.0。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱定經五氧化二磷減壓干燥至恒重的牛磺熊去氧膽酸鈉鹽對照品10.47 mg(折合成牛磺熊去氧膽酸為10.01 mg)置于10 ml量瓶中, 用甲醇定容至刻度, 搖勻得1.00 mg/ml牛磺熊去氧膽酸對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取牛磺熊去氧膽酸膠囊內容物,混勻, 研細, 精密稱取32.07 mg(約相當于牛磺熊去氧膽酸25.04 mg), 置于25 ml量瓶中, 加入甲醇20 ml, 超聲提取5 min, 放冷至室溫, 再加甲醇定容至刻度, 搖勻, 經0.45 μm微孔濾膜過濾, 取續濾液作為牛磺熊去氧膽酸供試品溶液。

2.3 方法專屬性考察 取處方量輔料按2.2.2項下方法制備輔料空白溶液, 再采用2.1項色譜條件, 分別精密量取20 μl牛磺熊去氧膽酸對照品溶液、供試品溶液、輔料空白溶液注入高效液相儀進行測定, 記錄色譜圖, 結果空白輔料在與牛磺熊去氧膽酸對照品峰相同的保留時間處無色譜峰出現, 表明空白輔料對牛磺熊去氧膽酸樣品的檢測無干擾。見圖1。

圖1 對照品(A)、供試品(B)、輔料空白(C)HPLC方法專屬性考察色譜圖

2.4 線性關系考察 精密稱取牛磺熊去氧膽酸對照品10.12 mg置于5 ml容量瓶中, 加甲醇溶解并稀釋至刻度, 作為對照品貯備液(2.02 mg/ml)。以進樣濃度10%～200%的濃度范圍內取6個濃度點(即10%、20%、50%、100%、120%、200%)進行線性回歸。以對照品濃度為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y), 繪制標準曲線, 得線性回歸方程：Y=4.593×106X+8788(r=0.9999), 表明牛磺熊去氧膽酸在0.0953～1.9050 mg/ml范圍內峰面積與濃度呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗 精密量取2.2.1項下的牛磺熊去氧膽酸對照品溶液20 μl連續進樣5次, 測得5次峰面積RSD=0.42%(n=5), 說明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 精密稱取同一批號(1165)的樣品適量, 按2.2.2項方法制備供試品溶液, 平行操作6份, 在上述色譜條件下, 測得牛磺熊去氧膽酸平均含量為99.87% RSD=0.56%,表明該方法重復性較好。

2.7 供試品溶液的穩定性試驗 精密稱取同一批號(1165)樣品6份, 按2.2.2項方法制備供試品溶液, 分別于配制后的0、2、4、8、24、48 h按上述色譜條件進樣測定, 記錄峰面積,牛磺熊去氧膽酸峰面積在48 h內RSD=0.18%, 結果表明牛磺熊去氧膽酸在48 h內穩定。

2.8 加樣回收率試驗 按處方比例, 取低(80%)、中(100%)、高(120%)3個不同濃度的牛磺熊去氧膽酸對照品, 分別加入處方量輔料, 混勻, 精密稱取適量(約相當于牛磺熊去氧膽酸對照品8、10、12 mg), 按2.2.2項下處理后, 進樣20 μl, 記錄色譜圖。另取牛磺熊去氧膽酸對照品儲備液, 同法測定,按外標法計算,3種含量的樣品中牛磺熊去氧膽酸的回收率分別為99.76%、99.81%、100.23%, 平均回收率為99.93%, RSD=0.26%。

2.9 樣品測定 分別精密量取20 μl牛磺熊去氧膽酸對照品溶液和供試品溶液, 按照2.1項色譜條件注入高效液相色譜儀, 記錄色譜圖, 按外標法計算2批牛磺熊去氧膽酸膠囊樣品的含量, 結果分別為標示量的99.76%(0907)和99.83% (1165)。

3 討論

3.1 實驗中取牛磺熊去氧膽酸對照品溶液在200～400 nm的波長范圍內掃描, 結果牛磺熊去氧膽酸僅有末端的紫外吸收,與張曉艷等[5]的研究一致, 考慮溶劑響應的影響, 因此將205 nm作為檢測波長。

3.2 曾參考相關文獻[5]甲醇0.05 mol/L磷酸二氫鈉(磷酸調節pH值4.5)(60：40)為流動相, 峰形不理想, 經比較, 采用本文流動相牛磺熊去氧膽酸主峰保留時間適中, 且峰形較滿意。試驗結果顯示, 線性關系、精密度、重復性等均能滿足用于牛磺熊去氧膽酸膠囊含量的測定。

3.3 在采用HPLC法測定牛磺熊去氧膽酸的含量時, 多以牛磺熊去氧膽酸鈉作為對照品, 計算結果再折算到牛磺熊去氧膽酸的含量, 與高鵬[6]的研究一致。

[1]王海龍, 吳成龍, 鄧勇, 等.牛磺熊去氧膽酸的合成.中國醫藥工業雜質,2009,40(2):88-89.

[2]沈俊, 周聃, 張若丹, 等. HPLC測定風熱清膠囊中的綠原酸和牛磺熊去氧膽酸.華西藥學雜志,2008,23(3):346-348.

[3]駱助林, 陳理國, 苗建國, 等.保膽取石術后口服牛磺熊去氧膽酸預防結石復發的臨床觀察.中國循證醫學雜志,2011,11(6):644-646.

[4]傅賢波, 林三仁, 范竹萍, 等.牛磺熊去氧膽酸溶解膽囊膽固醇結石有效性和安全性—隨機、雙盲、安慰劑對照、多中心臨床研究.中國微創外科雜志,2007,7(12):1159-1163.

[5]張曉艷, 崔蕊, 賈建靜, 等. HPLC測定牛磺熊去氧膽酸膠囊中的有關物質.華西藥學雜質,2012,27(5):585-587

[6]高鵬. HPLC法測定消痔軟膏中牛磺熊去氧膽酸的含量.山東中醫雜志,2011,30(3):198-199.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.16.194

2015-03-24]

611137 成都中醫藥大學藥學院(劉小雙 蒲旭峰)；成都欣捷高新技術開發有限公司(歐世榮 楊蕊)